[发明专利]一种狂犬病疫苗病毒的传代培养方法、狂犬病疫苗的制备方法

说明书

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种狂犬病疫苗病毒的筛选方法、狂犬病疫苗的制备方法。该筛选方法采用超高MOI与超低MOI交替循环的方式对狂犬病毒毒株进行培养，可使病毒快速地适应细胞，传6或8代，病毒滴度由4.6lgFFU/ml升至7.5lgFFU/ml，明显缩短毒种的传代适应周期，大大提高了病毒的产率与疫苗的生产效率，适于狂犬病疫苗的规模化生产。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种狂犬病疫苗病毒的筛选方法、狂犬病疫苗的制备方法。

背景技术

狂犬病病毒是一种神经组织嗜性病毒，属弹状病毒科(Rhabdoviridaes) 狂犬病病毒属(Lyssavirus)，是致死性狂犬病的病原体。包括人在内的几乎所有的温血动物均易感染狂犬病病毒。

狂犬病又称恐水病，是由狂犬病病毒感染引起的急性人兽共患传染病。一旦发病，几乎100％死亡。WHO推荐最有效的方法是狂犬病病毒暴露后及时进行疫苗接种。从狂犬病疫苗的发明至今130多年的历史，从最初的动物神经组织疫苗、禽胚疫苗细胞疫苗发展到如今的人二倍体细胞狂犬疫苗(HDCV) 与Vero细胞狂犬疫苗。现今，国内市场上使用最多的狂犬疫苗是Vero细胞纯化疫苗。

二倍体细胞属人源细胞，无异源性；具有正常核型，无致癌性；二倍体细胞狂犬疫苗具有高免疫源和良好的安全性，成为评价任何一种人用新疫苗的标准疫苗。由于人二倍体细胞基质具有其独特的工艺与安全优越性，未来人源性二倍体细胞基质生产的狂犬疫苗的运用会越来越广泛。目前，HDCV市场的售价昂贵，主要原因是HDCV生产中，培养的狂犬病毒滴度较低。

狂犬病毒在二倍体细胞培养需要先在该细胞上传代适应。国内外有大量的相关研究与报道，US3397267报道了CVS、PM、HEP毒株在WI-38细胞传代适应的研究，传代过程中，逐渐增加未感染病毒细胞的比例，经过30-40 代的传代，使病毒在二倍体细胞适应。使病毒从3.02logLD₅₀/ml提高到7.0 logLD₅₀/ml。我国中检所的严子林等人采用类似的方法，将CTN固定毒的脑悬液传40代后适应于KMB-17细胞中传代。浙江普康生物的毛子安等人将狂犬病毒的固定毒CTN-1V5株在KMB-17细胞中传代，以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，由第一代的4.5logLD₅₀/ml提高到20代的6.9logLD₅₀/ml，传至47代，病毒滴度基本稳定在7.0logLD₅₀/ml。

以上这些方法均采用带毒传代并且加大新鲜细胞比例的方法，需要传40 代以上才能适应，耗时太长，且病毒滴度较低。

云南沃森的杨喆等人，将新鲜病毒接种人二倍体细胞，带毒传代，需要 4-5个循环传代12-15代，病毒滴度从P1带的3.0logLD₅₀/ml，提升至P15代的7.0logLD₅₀/ml以上。病毒适应周期至少缩短了50％，但仍需要传15代，适应周期仍然较长。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种适应周期短、病毒滴度较高的狂犬病疫苗病毒的筛选方法。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种狂犬病疫苗病毒的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将狂犬病毒毒株按超高MOI 1-1000接种到人二倍体细胞感染吸附，加培养液培养，获得第一代病毒P1；

步骤2：将P1按超低MOI 0.00001-0.001接种到人二倍体细胞感染吸附，加生长液培养，弃去生长液，加培养液继续培养，获得第二代病毒P2；

步骤3：将步骤1～2重复2或3次，收集P6或P8代病毒。

在一些实施方案中，所述超高MOI为1000、100、10或1。