[发明专利]一种采用多重PCR法鉴定日本血吸虫尾蚴性别的方法在审
| 申请号： | 201910036428.4 | 申请日： | 2019-01-15 |
| 公开（公告）号： | CN109536623A | 公开（公告）日： | 2019-03-29 |
| 发明（设计）人： | 许静;段中良;李春香;王小莉;刘磊;夏超明 | 申请（专利权）人： | 苏州大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6888 | 分类号： | C12Q1/6888;C12Q1/6879;C12Q1/686;C12N15/11 |
| 代理公司： | 苏州市中南伟业知识产权代理事务所(普通合伙) 32257 | 代理人： | 殷海霞 |
| 地址： | 215000 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 多重PCR 尾蚴 日本血吸虫尾蚴 日本血吸虫 性染色体 设计一对引物 生物检测技术 实验动物模型 动物模型 区域设计 性别鉴定 序列特征 构建 扩增 引物 耗时 感染 节约 | ||
1.一种采用多重PCR法鉴定日本血吸虫尾蚴性别的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)日本血吸虫尾蚴样本选取：每只钉螺逸出的日本血吸虫尾蚴挑取3～5份样本，每份样本中日本血吸虫尾蚴的条数分别设置为1～10条；
(2)DNA提取：对步骤(1)选取的样本进行DNA提取，得到日本血吸虫尾蚴DNA模板；
(3)日本血吸虫尾蚴性别鉴定：采用多重PCR检测试剂对步骤(2)得到的日本血吸虫尾蚴DNA模板进行PCR反应，鉴定日本血吸虫尾蚴性别；
其中，多重PCR检测试剂包括：
日本血吸虫特异性引物，上下游引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：
上游引物Pm0F：5’-GGTGAAACATCATAAGACTAGAATT-3’；
下游引物Pm8R：5’-GCGCTTTCTGTGTACCAAAACTTAG-3’；
雌性日本血吸虫特异性引物，上下游引物分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示：
上游引物Pf5F：5’-CTCAGTGTGTAACATGCGTACTT-3’；
下游引物Pf8R：5’-TCGCTTTCTGTGTACTAAAACTTAA-3’。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多重PCR检测试剂还包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP和Taq聚合酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的PCR缓冲液包括200～500mM KCl和100mM Tris-HCl。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应的扩增程序为94℃ 3～5min；94℃ 30s～1min，52℃ 30s～50s，72℃ 30s～1min，30～35个循环；72℃ 5～7min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的DNA提取包括如下步骤：将日本血吸虫尾蚴裂解液加入到日本血吸虫尾蚴样本中，50～60℃孵育5～15min，然后在90～100℃处理1～2min，离心取上清液，得到日本血吸虫尾蚴DNA模板。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的日本血吸虫尾蚴裂解液为45～55mMTris碱，4～6％Tween20，45～55μg/ml蛋白酶K，pH为7.6-8.0。
7.一种用于鉴定日本血吸虫尾蚴性别的引物，其特征在于，包括：
日本血吸虫特异性引物，上下游引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：
上游引物Pm0F：5’-GGTGAAACATCATAAGACTAGAATT-3’；
下游引物Pm8R：5’-GCGCTTTCTGTGTACCAAAACTTAG-3’；
雌性日本血吸虫特异性引物，上下游引物分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示：
上游引物Pf5F：5’-CTCAGTGTGTAACATGCGTACTT-3’；
下游引物Pf8R：5’-TCGCTTTCTGTGTACTAAAACTTAA-3’。
8.一种用于鉴定日本血吸虫尾蚴性别的试剂盒，其特征在于，包含权利要求7所述的引物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR缓冲液、dNTP和Taq聚合酶。
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