[发明专利]一种采用多重PCR法鉴定日本血吸虫尾蚴性别的方法

说明书

本发明公开了一种采用多重PCR法鉴定日本血吸虫尾蚴性别的方法，属于生物检测技术领域。本发明依据日本血吸虫二性染色体Z染色体设计一对引物，再从W染色体中雌性序列特征性扩增区域设计引物一对，构建多重PCR体系，该体系可同时鉴定雌性和雄性尾蚴。本发明多重PCR法鉴定尾蚴性别的全过程约耗时4h，较已有报道大幅缩短了尾蚴性别鉴定时间。一方面节约了建立感染日本血吸虫动物模型的时间，另一方面可以依据尾蚴的性别，更加准确地建立所需要的实验动物模型。

技术领域

本发明涉及一种采用多重PCR法鉴定日本血吸虫尾蚴性别的方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

血吸虫是唯一具有两性染色体的吸虫，有8对染色体，其中雌性染色体为ZW，雄性为ZZ。尽管在成虫阶段有明显的二态性，雌虫和雄虫可用肉眼判别，但是在其感染阶段即尾蚴阶段肉眼难以辨别雌雄。准确、高效地鉴定血吸虫尾蚴性别，有助于对血吸虫的遗传学、流行病学和病理学研究结果等作出正确评价，并且对于抗血吸虫药物的研发以及准确评价实际感染度和控制日本血吸虫病病期具有实际意义。

传统动物感染方法，是在实验室内取感染血吸虫的鼠或其它啮齿类动物的肝、肠或粪便收集虫卵，孵化毛蚴，用单只毛蚴感染单只钉螺，养殖筛选阳性钉螺，获得单性尾蚴，用以感染啮齿动物，待其发育至成虫阶段，解剖动物收集成虫，用肉眼或在解剖显微镜下根据形态学的差异，确定感染尾蚴性别。然而，单雌性尾蚴进入宿主体内后，难以发育到成虫阶段，给鉴别带来一定困难。此外，传统动物感染方法费时费力，不能满足快速鉴别的需求。

国外学者采用着色粒显带技术(Chromosome Banding)对曼氏血吸虫尾蚴性别进行鉴定，准确率高达100％。该技术原理是：曼氏血吸虫雌性幼虫及成虫的细胞分裂间期的细胞核显示出W-染色体上存在异色块，而雄性成虫及尾蚴性染色体上没有此异色块。因此，用C-band方法处理尾蚴胞核，制成染色标本片，在显微镜下根据异色块的有无，可区分曼氏血吸虫尾蚴、毛蚴、胞蚴和成虫的性别。经实验发现日本血吸虫、埃及血吸虫等的尾蚴经C-band技术检查细胞核后不能有性繁殖，而且因日本血吸虫和埃及血吸虫雌性成虫及尾蚴的W染色体上无此特征性间质异色块，Z染色体上也不存在，故该方法不能用于日本血吸虫和埃及血吸虫尾蚴的性别鉴定。

代表性差异分析(representational difference analysis,RDA)法是基于递减杂交法，用于发现两DNA基因组群间差异，是一种改良的差减杂交法，可用于分离基因组间差异性片段。国内外许多学者应用代表差异性分析方法，利用日本血吸虫雄虫基因扣除雌虫基因，从而获得雌虫特异性序列，以此来特异性鉴别雌性虫体和雄性虫体。遗憾的该法仅能够找到雌性虫体特异性序列，但在尾蚴性别鉴定中，没有实用价值。

DNA探针杂交技术针对血吸虫雌性虫体特异性序列制备DNA探针，用于鉴别血吸虫雌性尾蚴。该法提供了一种非常有效的尾蚴性别鉴定方法，但需要提取几百乃至上千条尾蚴的DNA，对单个尾蚴的性别鉴定没有足够的灵敏性。

国内学者采用限制性位点扩增多态性(RSAP)标记进而探讨日本血吸虫不同虫株的遗传变异。在筛选的45对引物中，标记物条带清楚的10对RSAP中只有6个呈现出在不同的分离株之间的多态性。其中，一对引物能够鉴别日本血吸虫雌虫和雄虫的一段162bp的特异性扩增序列。在此序列上，设计出一对特定的引物，建立序列表征扩增区(SCAR)-PCR检测方法，鉴别日本血吸虫雌性成虫。其检测的灵敏度为0.3ng，且与肝片形虫、华支睾吸虫以及曼氏血吸虫雌虫和雄虫均无交叉反应。但是该方法仅针对雌虫特异性扩增区域设计引物，仍不能够准确鉴定尾蚴性别。例如，对于没有得到扩增条带的样本，无法确定该钉螺逸出的尾蚴为雄性尾蚴，还必须排除为抽提到样本DNA的可能。对于得到特异性扩增条带的样本，亦无法确认该样本为单雌性尾蚴，还必须排出雌性尾蚴和雄性尾蚴混合感染的情况。

发明内容