[发明专利]一种软骨细胞体外扩增方法

权利要求书

1.一种软骨细胞体外扩增方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1、对软骨进行处理，得到软骨细胞；

步骤2、将软骨细胞接种至培养基中进行细胞原代培养；

步骤3、待步骤1中软骨细胞生长至70～80％汇合后进行细胞传代培养；其中，

在步骤2中，所述培养基选自BME培养液、MEM培养液、HAM培养液或DMEM培养液，优选为DMEM培养液，更优选地，在所述培养基中含有：5～20％的血清、20～40ng/mL bFGF和20～40ng/mL PDGF；

在步骤3中，进行细胞传代培养的培养基选自BME培养液、MEM培养液、HAM培养液或DMEM培养液，更优选地，在所述培养基中含有：5～20％的血清、20～40ng/mL bFGF、20～40ng/mLPDGF、1～10ng/mL IGF-I。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1中，所述处理如下进行：

步骤1-1、将软骨切成0.8～1.2mm³的块状体，并采用冲洗介质进行冲洗；

步骤1-2、冲洗后采用消化介质进行消化处理，得到悬浮状软骨细胞，然后利用细胞滤器过滤得到单个的悬浮细胞；

步骤1-3、进行离心分离，收集细胞沉淀，得到软骨细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

在步骤1-1中，所述冲洗介质为Ham'sF12介质，优选地，在所述冲洗介质中含有5～15mmol/L HEPES缓冲液、60～80μmol/L硫酸庆大霉素、20～25μmol/L二性霉素B和250～350μmol/L抗坏血酸，更优选地，在所述冲洗介质中含有10mmol/L HEPES缓冲液、70μmol/L硫酸庆大霉素、22μmol/L二性霉素B和300μmol/L抗坏血酸；和/或

在步骤1-2中，所述消化介质为Ham'sF12配制的含1～2mg/mL的II型胶原酶，例如1.5mg/mL的II型胶原酶；优选地，在步骤1-2中，于37℃下消化处理13～15h。

4.根据权利要求1至3之一所述的方法，其特征在于，在步骤2中，在所述培养基中含有：5～10％的血清、25～35ng/mL bFGF和25～35ng/mL PDGF，优选地，在所述培养基中含有：8％的血清、30ng/mL bFGF和30ng/mL PDGF。

5.根据权利要求1至4之一所述的方法，其特征在于，在步骤2中，

在所述培养基中还含有：10-12mmol/L HEPES缓冲液、70-75μmol/L硫酸庆大霉素和22-25μmol/L二性霉素B；

优选地，在所述培养基中还含有：11mmol/L HEPES缓冲液、72μmol/L硫酸庆大霉素和24μmol/L二性霉素B。

6.根据权利要求1至5之一所述的方法，其特征在于，在步骤3中，

进行细胞传代培养的培养基为DMEM培养液，在所述培养基中含有：5～10％的血清、25～35ng/mL bFGF、25～35ng/mL PDGF、2～8ng/mL IGF-I；

优选地，进行细胞传代培养的培养基为DMEM培养液，在所述培养基中含有：8％的血清、30ng/mL bFGF、30ng/mL PDGF、5ng/mL IGF-I。

7.根据权利要求1至6之一所述的方法，其特征在于，在步骤3中，

在传代培养的培养基中还含有：10-12mmol/LHEPES缓冲液、70-75μmol/L硫酸庆大霉素、22-25μmol/L二性霉素B和300-310μmol/L抗坏血酸；

优选地，在传代培养的培养基中还含有：11mmol/L HEPES缓冲液、72μmol/L硫酸庆大霉素、24μmol/L二性霉素B和305μmol/L抗坏血酸。