[发明专利]一种软骨细胞体外扩增方法

说明书

本发明公开了一种软骨细胞体外扩增方法，所述方法包括细胞原代培养和细胞传代培养，其中，在原代培养基中加入bFGF和PDGF等生长因子促进原代细胞培养，在传代培养基中加入具有相互协同作用的具有相互协同作用的bFGF、PDGF和IGF‑I等生长因子促进传代细胞培养，这样，不仅促进细胞数量扩增，同时可以有效避免细胞肥大化；同时，原代采用二维培养使软骨细胞适宜扩增，并优选传代采用三维培养以恢复退变的软骨组织表型，这样，在达到扩增软骨细胞数目的时，又能保持正常组织表型。

技术领域

本发明属于细胞培养领域，尤其涉及软骨细胞体外培养扩增。

背景技术

软骨细胞是关节软骨内唯一的细胞类型，是终末细胞，在关节滑膜液的内环境下缺乏增殖能力，加上关节软骨没有血液供应，一旦破坏，缺乏再生修复能力。包括将从自体其他部位采集软骨组织移植到缺损部位进行治疗的方法，该方法存在采集部位选择和采集量有限的问题，不能有效适用。

因此，亟需一种高效的软骨细胞体外扩增方法。

发明内容

为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，在原代培养基中加入bFGF和PDGF等生长因子促进原代细胞培养，在传代培养基中加入具有相互协同作用的bFGF、PDGF和IGF-I等生长因子促进传代细胞培养，这样，不仅促进细胞数量扩增，同时可以有效避免细胞肥大化；同时，原代采用二维培养使软骨细胞适宜扩增，并优选传代采用三维培养以恢复退变的软骨组织表型，这样，在达到扩增软骨细胞数目的时，又能保持正常组织表型，从而完成本发明。

本发明的一方面在于提供一种软骨细胞体外扩增方法，具体体现在以下几个方面：

(1)一种软骨细胞体外扩增方法，其中所述方法包括以下步骤：

步骤1、对软骨进行处理，得到软骨细胞；

步骤2、将软骨细胞接种至培养基中进行细胞原代培养；

步骤3、待步骤1中软骨细胞生长至70～80％汇合后进行细胞传代培养；其中，

在步骤2中，所述培养基选自BME培养液、MEM培养液、HAM培养液或DMEM培养液，优选为DMEM培养液，更优选地，在所述培养基中含有：5～20％的血清、20～40ng/mL bFGF和20～40ng/mL PDGF；

在步骤3中，进行细胞传代培养的培养基选自BME培养液、MEM培养液、HAM培养液或DMEM培养液，更优选地，在所述培养基中含有：5～20％的血清、20～40ng/mL bFGF、20～40ng/mL PDGF、1～10ng/mL IGF-I。

(2)根据上述(1)所述的方法，其中，在步骤1中，所述处理如下进行：

步骤1-1、将软骨切成0.8～1.2mm³的块状体，并采用冲洗介质进行冲洗；

步骤1-2、冲洗后采用消化介质进行消化处理，得到悬浮状软骨细胞，然后利用细胞滤器过滤得到单个的悬浮细胞；

步骤1-3、进行离心分离，收集细胞沉淀，得到软骨细胞。

(3)根据上述(2)所述的方法，其中，

在步骤1-1中，所述冲洗介质为Ham'sF12介质，优选地，在所述冲洗介质中含有5～15mmol/L HEPES缓冲液、60～80μmol/L硫酸庆大霉素、20～25μmol/L二性霉素B和250～350μmol/L抗坏血酸，更优选地，在所述冲洗介质中含有10mmol/L HEPES缓冲液、70μmol/L硫酸庆大霉素、22μmol/L二性霉素B和300μmol/L抗坏血酸；和/或