[发明专利]一种外泌体的制备方法及应用

权利要求书

1.一种外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：

采用差速离心法对类器官的培养上清液进行处理，分离得到所述外泌体。

2.如权利要求1所述的外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括5次离心。

3.如权利要求1所述的外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括以下步骤：

1)离心去除活细胞；

2)离心去除死细胞；

3)离心去除细胞碎片；

4)离心去除囊泡结构；

5)离心得到外泌体。

4.如权利要求3所述的外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括以下步骤：

1)去除活细胞：对类器官培养上清进行离心，离心条件为4℃，300g-500g，10分钟，得到上清液1和沉淀1；

2)去除死细胞：对上清1进行离心，离心条件为4℃，2,000g，10-20分钟，得到上清液2和沉淀2；

3)去除细胞碎片：对上清2进行离心，离心条件为4℃，10,000g，20-30分钟，得到上清液3和沉淀3；

4)去除囊泡结构：对上清3进行离心，离心条件为4℃，100,000g，70-120分钟，得到上清液4和沉淀4；

5)得到外泌体：对上清4进行离心，离心条件为4℃，100,000g，70-120分钟，得到上清液5和沉淀5；

所述沉淀5即为所述外泌体。

5.如权利要求4所述的外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括以下步骤：

1)去除活细胞：对类器官培养上清进行离心，离心条件为4℃，500g，10分钟，得到上清液1和沉淀1；

2)去除死细胞：对沉淀1进行离心，离心条件为4℃，2 000g，20分钟，得到上清液2和沉淀2；

3)去除细胞碎片：对沉淀2进行离心，离心条件为4℃，10 000g，30分钟，得到上清液3和沉淀3；

4)去除囊泡结构：对沉淀3进行离心，离心条件为4℃，100 000g，120分钟，得到上清液4和沉淀4；

5)得到外泌体：对沉淀4进行离心，离心条件为4℃，100 000g，120分钟，得到上清液5和沉淀5；

所述沉淀5即为所述外泌体。

6.如权利要求4或5所述的外泌体的制备方法，其特征在于，步骤5)中，在离心之前，对所述上清液4进行重悬。

7.如权利要求1所述的外泌体的制备方法，其特征在于，所述类器官为癌组织、癌旁组织或正常组织，经体外3D立体培养获得的类器官。

8.一种外泌体，由权利要求1-7任一所述方法制得。

9.如权利要求8所述的外泌体的检测方法，至少包括以下步骤：

1)将所述外泌体冻干，进行溶液内酶解，得到肽段；

2)对步骤1)中得到的所述肽段进行脱盐，得到脱盐肽段；

3)对步骤2)中得到的脱盐肽段进行荧光定量；

4)对步骤2)中得到的脱盐肽段进行质谱分析。

10.如权利要求9所述的外泌体检测方法，其特征在于，步骤4)中，根据步骤2)中脱盐肽段的序列信息，采用与其序列相同的相应重标脱盐肽段进行质谱分析。

11.权利要求8所述外泌体在制备肿瘤治疗药物和/或肿瘤分子标记物中的应用。