[发明专利]一种液质联用测定血浆中吡嗪酰胺浓度的方法

权利要求书

1.一种液质联用测定血浆中吡嗪酰胺浓度的方法，其特征在于：血浆样品经预处理后经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，具体方法包括以下步骤：

(1)血浆样品预处理：

以K₂EDTA为抗凝剂，以吡嗪酰胺-d3为内标；于96深孔板中精密加入100uL的血浆样品，加入5uL的体积比为1：1的乙腈水溶液，混匀后加入5uL的0.01ug/uL的内标吡嗪酰胺-d3溶液，混匀后加入1000uL乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于20℃以3000rpm离心10min，取上层清液50uL至装有1000uL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为水：甲醇：甲酸按照体积比95：5：0.1混合得到的混合物，涡旋混匀，于20℃以3000rpm离心5min后作为测试样品待检测；

(2)试样测定：

取10uL测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中吡嗪酰胺和内标吡嗪酰胺-d3的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的吡嗪酰胺浓度；

(3)液相色谱条件：

色谱柱：Synergi^TM4umPolar-RP80A，柱规格为50×2mm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸的体积比为100/0.1；流动相B：甲醇/甲酸的体积比为100/0.1；洗液：乙腈/水的体积比为50/50；自动进样器温度为15℃；梯度洗脱，流速为0.4mL/min，进样量为10uL，分析时间3.5min；

(4)质谱条件：

离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为4500V，雾化温度为450℃，喷雾气压力为30Psi，辅助加热气压力为30Psi，气帘气压力为30Psi，碰撞气压力为8Psi，去簇电压分别为20eV的吡嗪酰胺和吡嗪酰胺-d3；碰撞室入口电压分别为13eV的吡嗪酰胺和吡嗪酰胺-d3；碰撞电压分别为25eV的吡嗪酰胺和吡嗪酰胺-d3；碰撞室出口电压分别为8eV的吡嗪酰胺和吡嗪酰胺-d3；正离子方式检测；扫描方式为多反应监测MRM；

用于定量分析的离子反应分别为：m/z124.0→m/z80.8，其为吡嗪酰胺；和m/z127.0→m/z83.7，其为吡嗪酰胺-d3。

2.根据权利要求1所述的一种液质联用测定血浆中吡嗪酰胺浓度的方法，其特征在于：所述步骤(3)中梯度洗脱的程序为：

3.根据权利要求1或2所述的一种液质联用测定血浆中吡嗪酰胺浓度的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，采用内标法，以吡嗪酰胺和内标吡嗪酰胺-d3的峰面积比值带入标准曲线方程计算所述血浆样品中的吡嗪酰胺的浓度。

4.根据权利要求3所述的一种液质联用测定血浆中吡嗪酰胺浓度的方法，其特征在于：所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：

取100uL空白血浆10份置于96深孔板中，以贮备液的形式分别添加5uL浓度分别为0.002μg/μL、0.004μg/μL、0.01μg/μL、0.02μg/μL、0.04μg/μL、0.1μg/μL、0.24μg/μL、0.4μg/μL的吡嗪酰胺溶液至最低定量下限样本、标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、最高定量上限样本中，分别添加5μl体积比为1：1的乙腈水溶液至空白样本和零浓度样本，混匀后分别向最低定量下限样本、标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、最高定量上限样本、零浓度样本中加入5uL的0.01ug/uL的内标吡嗪酰胺-d3溶液，向空白样本中加入5uL的体积比为1：1的乙腈水溶液，混匀后分别向10份样本中加入1000uL乙腈于96深孔板中，涡旋混合1min，于20℃以3000rpm离心10min，取上层清液50uL至装有1000uL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为水：甲醇：甲酸按照体积比95：5：0.1混合得到的混合物，涡旋混匀，于20℃以3000rpm离心5min，分别作为10份标准样品待检测；

分别取10uL标准样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中的吡嗪酰胺和内标吡嗪酰胺-d3的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于计算所述血浆中的吡嗪酰胺的浓度。