[发明专利]一种全细胞一步合成L-肌肽的方法

说明书

本发明公开了一种全细胞一步合成L‑肌肽的方法，包括以下步骤：1)构建重组载体，所述重组载体含有核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸脂酰基转移酶基因，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；2)将核苷酸序列SEQ ID NO.1所示的基因转入大肠杆菌获得重组大肠杆菌；3)将底物β‑丙氨酸甲酯以及L‑组氨酸溶于缓冲溶液，pH值为7.5‑9.5；4)将重组大肠杆菌加入缓冲溶液中进行反应，反应温度25‑42℃；本发明利用该基因的重组质粒和重组工程菌在催化体系中直接催化合成L‑肌肽，提高了L‑肌肽的转化率，同时解决了氨肽酶法催化过程繁复的酶分离纯化和高成本的难题。

技术领域

本发明涉及一种肌肽的合成方法，具体是一种直接采用重组大肠杆菌作为全细胞催化剂高效率合成L-肌肽的方法，属于生物生产技术领域。

背景技术

L-肌肽(β-丙氨酰-L-组氨酸)及其类似物(如高肌肽和鹅肌肽)，是广泛存在于哺乳动物的大脑、肌肉和其他重要组织中的天然活性二肽。自该活性肽发现的一百多年来，已有大量的研究发现或者证明L-肌肽具有显著的抗氧化、消除胞内自由基、抗衰老等活性，并且在临床上用于高血压、心脏病、老年性白内障、溃疡、抗肿瘤、促进伤口愈合等方面的辅助治疗。由于其抗氧化的活性强，毒副作用低并具有多种生理活性，该活性肽及其衍生物在医药、保健、卫生、化妆品等领域已有广泛的应用，市场空间广阔。

目前L-肌肽的生产主要采用化学合成法。已有的化学合成方法比较多，主要可以分为两大类：(1)利用β-丙氨酸参与合成。其主要路线是β-丙氨酸经氨基保护、羧基活化后与保护的L-组氨酸缩合，然后脱掉保护基团得到L-肌肽。该路线由于各个保护基团的差异导致合成路线较多。其中常用的方法是利用邻苯二甲酸酐与β-丙氨酸生成邻苯二甲酰-β-丙氨酸保护氨基，羧基与氯化亚砜反应生成邻苯二甲酰-β-丙氨酰氯，再与保护的L-组氨酸形成肽键后脱保护基团得到产品。该路线比较复杂，收率低，肽键形成过程中易消旋，影响产品纯度，并且溶剂消耗大，易造成环境污染；(2)无β-丙氨酸参与的反应：主要原理为L-组氨酸先与不同的β-丙氨酸前体生成肽键，再进一步转换为肌肽。常用的路线是在醇钠作用下，L-组氨酸和氰乙酸乙酯发生酰化反应，得到氰基乙酰-L-组氨酸，经催化氢化还原得L-肌肽。该路线相对简单，省去对不同基团的保护和脱保护的过程，避免消旋反应的发生，但是采用了易水解的醇纳，需要无水操作，要求严格，并未工业化应用。同时，氰乙酸乙酯为环境毒害物质，易引起水体污染和毒性反应。

目前，已有采用温和环保的酶催化合成方法，以取代传统化学合成工艺的报道。如采用氨肽酶催化β-丙氨酸甲酯与L-组氨酸一步合成L-肌肽(申请公布号为CN107217048A的专利文献)。采用重组氨肽酶全细胞合成L-肌肽等方法的报道(Heyland J,N Antweiler,JLutz,et al.Simple enzymatic procedure for L-carnosine synthesis:whole-cellbiocatalysis and efficient biocatalyst recycling[J].Microbial Biotechnology,2010,3(1):74-83.)。然而，由于氨肽酶具有很高的外切酶活力，导致在反应体系中无法积累高浓度的L-肌肽。并且，利用氨肽酶合成L-肌肽对反应体系要求较高，往往需要水相和有机相体系，以减少产物的水解作用。但是有机相对酶的活力存在一定程度抑制，氨基酸底物在有机相中溶解度也较低，种种原因都导致基于氨肽酶合成L-肌肽的产量很低(最优结果是3.7g/L，Microbial Biotechnology,2010,3(1):74-83.)。除此之外，氨肽酶会形成三肽，导致反应产物复杂、提取纯化困难、L-肌肽得率较低(Heck T,V S Makam,J Lutz,etal.Kinetic Analysis of L-Carnosine Formation byβ-Aminopeptidases.AdvancedSynthesisCatalysis,2010,352(2-3):407-415.)。并且，采用生物酶法制备、分离成本高昂，难以回收再利用，不利于大规模运用。

发明内容