[发明专利]一种一步法合成L-肌肽的方法及截短的L-肌肽合成酶

权利要求书

1.一种一步法合成L-肌肽的方法，其特征在于:以β-丙氨酸、L-组氨酸、ATP和聚磷酸盐为原料，MgCl₂为激活剂，加入L-肌肽合成酶和聚磷酸盐激酶，在pH 6.5-8.5,30-45 ℃温度条件下通过酶促反应偶联催化合成肌肽；包括以下步骤：

（1）分别构建截短的L-肌肽合成酶基因重组表达载体pET-CARNS1和聚磷酸盐激酶基因重组表达载体pET-Ppk；其中，所述截短的L-肌肽合成酶基因来源于Gallus gallus，将该序列经密码子优化后其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列；聚磷酸盐激酶基因来源于E.coli K-12 (MG 1655)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；截短的L-肌肽合成酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

（2）分别将步骤(1)中的重组表达载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得基因工程重组菌株E.coli pET-CARNS1和E.coli PET-PPK；

（3）培养步骤(2)中的重组菌株，从而获得表达截短的L-肌肽合成酶和聚磷酸盐激酶的菌体；

（4）破碎步骤(3)中的菌体获得粗酶液，经镍柱纯化后混合；

（5）将步骤(4)中获得的混合酶液加入含有80-150 mMβ-丙氨酸、80-150 mM L-组氨酸、5 mM MgCl₂、3.0-6.0 mM ADP和30-50 mM六偏磷酸钠的催化液中，在pH值为6.5-8.5,温度为30-45℃条件下进行酶促反应合成肌肽。

2.根据权利要求1所述的一种一步法合成L-肌肽的方法，其特征在于：所述步骤(3)中重组菌株的培养方法为:重组菌株按体积百分比的1-2%接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，180-220rpm培养至OD600达到0.6-0.8时，添加终浓度0.2-0.5 mMIPTG，于25-28℃诱导培养8-10h，收集菌体。

3.根据权利要求2所述的一种一步法合成L-肌肽的方法，其特征在于：所述LB液体培养基每升包括10g氯化钠、5g酵母粉、10g蛋白胨，pH值为7.2-7.4。

4.根据权利要求1所述的一种一步法合成L-肌肽的方法，其特征在于：所述催化液为50mM磷酸缓冲液中含有浓度为100 mMβ-丙氨酸、100 mM L-组氨酸、5 mM MgCl₂、5 mM ADP和50 mM六偏磷酸钠。

5.一种截短的L-肌肽合成酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。