[发明专利]一种一步法合成L-肌肽的方法及截短的L-肌肽合成酶

说明书

本发明公开了一种一步法合成L‑肌肽的方法及截短的L‑肌肽合成酶，该方法以β‑丙氨酸、L‑组氨酸、ATP和聚磷酸盐为原料，MgCl₂为激活剂，加入L‑肌肽合成酶和聚磷酸盐激酶，在pH 6.5‑8.5,30‑45℃温度条件下通过酶促反应偶联催化合成肌肽；本发明利用大肠杆菌分别表达截短的L‑肌肽合成酶(其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)和聚磷酸盐激酶，经纯化后混合形成双酶偶联体系，截短表达的L‑肌肽合成酶催化β‑丙氨酸和L‑组氨酸合成L‑肌肽，同时伴随着ATP去磷酸化形成ADP，聚磷酸盐激酶则催化聚磷酸盐转磷酸基团给ADP形成ATP，从而实现ATP的循环再生；利用双酶偶联体系，在合适的反应条件下反应得到肌肽；本发明的方法具有原料价格低廉、酶转化时间短、操作简便以及生产成本低等优点。

技术领域

本发明涉及一种肌肽的制备方法，具体是一种一步法合成L-肌肽的方法，属于生物生产技术领域。

背景技术

L-肌肽(β-丙氨酰-L-组氨酸)及其类似物(如高肌肽和鹅肌肽)，是广泛存在于哺乳动物的大脑、肌肉和其他重要组织中的天然活性二肽。自该活性肽发现的一百多年来，已有大量的研究发现或者证明L-肌肽具有显著的抗氧化、消除胞内自由基、抗衰老等活性，并且在临床上用于高血压、心脏病、老年性白内障、溃疡、抗肿瘤、促进伤口愈合等方面的辅助治疗。由于其抗氧化的活性强，毒副作用低并具有多种生理活性，该活性肽及其衍生物在医药、保健、卫生、化妆品等领域已有广泛的应用，市场空间广阔。

目前L-肌肽的生产主要采用化学合成法。已有的化学合成方法比较多，主要可以分为两大类：(1)利用β-丙氨酸参与合成。其主要路线是β-丙氨酸经氨基保护、羧基活化后与保护的L-组氨酸缩合，然后脱掉保护基团得到L-肌肽。该路线由于各个保护基团的差异导致合成路线较多。其中常用的方法是利用邻苯二甲酸酐与β-丙氨酸生成邻苯二甲酰-β-丙氨酸保护氨基，羧基与氯化亚砜反应生成邻苯二甲酰-β-丙氨酰氯，再与保护的L-组氨酸形成肽键后脱保护基团得到产品。该路线比较复杂，收率低，肽键形成过程中易消旋，影响产品纯度，并且溶剂消耗大，易造成环境污染；(2)无β-丙氨酸参与的反应：主要原理为L-组氨酸先与不同的β-丙氨酸前体生成肽键，再进一步转换为肌肽。常用的路线是在醇钠作用下，L-组氨酸和氰乙酸乙酯发生酰化反应，得到氰基乙酰-L-组氨酸，经催化氢化还原得L-肌肽。该路线相对简单，省去对不同基团的保护和脱保护的过程，避免消旋反应的发生，但是需要无水操作，要求严格。同时，氰乙酸乙酯为环境毒害物质，易引起水体污染和毒性反应。

目前，已有采用温和环保的酶催化合成取代传统化学合成工艺的报道。如采用氨肽酶催化β-丙氨酸甲酯与L-组氨酸一步合成L-肌肽(申请公布号为CN107217048A的专利文献)。该方法依然需要将β丙氨酸甲酯化，并且反应液中合成的L-肌肽会被氨肽酶降解为β-丙氨酸和L-组氨酸，同时，氨肽酶会形成三肽，导致反应产物复杂、提取纯化困难、L-肌肽得率较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种一步法合成L-肌肽的方法，该方法具有原料价格低廉、酶转化时间短、操作简便以及生产成本低等优点，具有较好的工业应用潜力。

为了达到上述技术目的，本发明的技术方案是：

一种一步法合成L-肌肽的方法，该方法以β-丙氨酸、L-组氨酸、ATP和聚磷酸盐为原料，MgCl₂为激活剂，加入L-肌肽合成酶和聚磷酸盐激酶，在pH6.5-8.5,30-45℃温度条件下通过酶促反应偶联催化合成肌肽。

具体地，包括以下步骤：