[发明专利]一种发根农杆菌介导的菠菜毛状根遗传转化体系

权利要求书

1.一种诱导菠菜毛状根及其培养和再生的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤如下：

(1)活化农杆菌LBA9402，当菌液浓度OD 600值到达0.6到0.8之间时，离心富集菌体，后用液体侵染液重悬菌液至OD 600值等于0.3；液体侵染液的成分及终浓度为在SH基础培养基中含有100μmol·L^-1乙酰丁香酮和15g·L^-1蔗糖；

(2)取20-35天的菠菜无菌苗的叶、叶柄和茎，将菠菜的无菌苗叶片剪成大小约5mm×5mm的小段，菠菜的叶柄和茎剪成长约为5mm小段，作为诱导菠菜毛状根的外植体；

(3)将已经剪好的外植体置于侵染液中，振荡孵育5分钟后晾干，在共培养培养基上共培养2天，然后转移到毛状根培养培养基；所述共培养培养基的成分为在SH基础培养基中含有终浓度15g·L^-1蔗糖、7.8g·L^-1琼脂和100μmol·L^-1乙酰丁香酮；毛状根培养培养基是在SH基础培养基中含有终浓度15g·L^-1蔗糖、7.8g·L^-1琼脂和300mg·L^-1特美汀；

(4)菠菜外植体产生毛状根后，20-40天毛状根能够稳定增殖生长，每14天继代一次；继代培养基为在固体SH基础培养基中含有终浓度15g·L^-1蔗糖、7.8g·L^-1琼脂和300mg·L^-1特美汀；

(5)取处于稳定生长的菠菜毛状根置于愈伤诱导培养基，20天继代1次；所述愈伤诱导培养基是在SH基础培养基中含有终浓度30g·L^-1蔗糖、7.8g·L^-1琼脂、4mg·L^-12,4-二氯苯氧乙酸、1mg·L^-16-苄氨基嘌呤和300mg·L^-1特美汀；

(6)将毛状根产生的愈伤用镊子轻剥，继代在分化培养基，在27℃下，光周期为8小时光照，16小时黑暗，培养30-40天；所述分化培养基是在SH基础培养基中含有30g·L^-1蔗糖、7.8g·L^-1琼脂、2mg·L^-16-苄氨基嘌呤和300mg·L^-1特美汀；

(7)将菠菜丛生芽分开，继代在生根培养基上；在27℃下，光周期为8小时光照，16小时黑暗，培养10-20天直至菠菜生根；所述生根培养基是在1/2MS基本培养基中含有15g·L^-1蔗糖和7.8g·L^-1琼脂。