[发明专利]一种发根农杆菌介导的菠菜毛状根遗传转化体系

说明书

一种发根农杆菌介导的菠菜毛状根遗传转化的方法。主要包括使用发根农杆菌侵染菠菜外植体后产生毛状根，再诱导菠菜毛状根产生愈伤，通过愈伤分化，获得菠菜毛状根的再生株。此外，本发明实现了发根农杆菌的Ri质粒与携带外源基因的Ti质粒的共转化，PCR结果和荧光显微镜观察显示,发根农杆菌Ri质粒的rol B基因以及Ti质粒中GFP基因已在菠菜毛状根基因组中稳定表达。

技术领域

本发明属于植物组培技术和植物转基因技术领域，具体地涉及一种诱导菠菜(Spinacia oleracea)毛状根及其培养和再生的方法。

背景技术

菠菜(Spinacia oleracea)属双子叶植物纲藜科菠菜属，是以绿叶为主要器官的一年生或二年生草本植物。菠菜为绿叶蔬菜类中最主要的一种，具有较高的营养价值。由于菠菜耐寒性好，生长周期短，1年内可多茬栽培，是四季尤其是冬淡季主要供应的蔬菜之一。

近年来随着人们对蔬菜的品质和营养价值等需求的日益提高，除了传统育种之外，分子生物学技术手段也常被用来进行蔬菜的新品种培育或进行蔬菜功能基因的挖掘和鉴定。通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtume faciens)里Ti质粒的T-DNA为媒介，将目的基因导入植物中，获得外源基因稳定表达的转基因株系，是研究植物基因功能和遗传改良的主要技术手段之一。除了根癌农杆菌，在自然界中，发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)可通过Ri质粒的T-DNA，将诱导发根的基因位点rol基因(rol A、rol B和rolC)稳定整合到宿主植物基因组中，产生毛状根。发根农杆菌也可以同时将Ri质粒中携带发根基因座的T-DNA和Ti质粒中携带外源基因的T-DNA共同整合到植物基因组中，实现共转化。很多植物，如苜蓿(Medicago sativa)的毛状根可以再生为具有正常育性的完整植株，这样允许在整个植株水平评价外源基因的功能。因此，通过发根菌建立遗传转化体系，可以另辟蹊径，作为植物遗传转化体系的另一选择。

发根农杆菌侵染植物的效率较高，易得到毛状根系。毛状根具有生长速度快，遗传稳定等特点，常用来作为很多重要研究的模型。例如番茄(Lycopersicon esculentum)的毛状根和野生根的外部形态及内部结构非常相似，根特异性基因的表达在正常根和毛状根中也无明显差别，因此，番茄的毛状根常被用来作为研究番茄根功能基因的一个模型。另外，部分植物能够在超量吸收重金属的同时保持正常生长代谢，如藜科植物菠菜根可以吸收重金属镉。相比于正常植物，毛状根生长条件简单可控，繁殖速度快，遗传性能稳定，已经代替整个植株成为研究植物修复重金属污染的重要模型之一。

鉴于毛状根的重要性，很多植物毛状根诱导及再生系统已经被建立，包括雪莲(Saussurea involucrata)、五寸石竹(Dianthus chinensis)、北玄参(Scrophularia buergeriana)。然而，藜科植物的毛状根体系的研究较为少见，目前仅有甜菜(Beta vulgaris)的毛状根诱导成功的研究报道。本发明第一次诱导出了藜科蔬菜植物菠菜的毛状根，并建立了菠菜毛状根再生体系，在毛状根里实现了Ti质粒共转化。该系统可以用于菠菜基因功能的鉴定，并为今后菠菜的基因工程改良和分子育种提供辅助。

发明内容

本发明的目的是提供一种诱导菠菜毛状根及其培养和再生的方法。利用本发明所述方法能够高效快捷的诱导菠菜毛状根，并且能得到菠菜毛状根再生植株。