[发明专利]一种重组菌及其在检测结核分枝杆菌菌株对药物的敏感性中的应用

说明书

本发明公开了一种重组菌及其在检测结核分枝杆菌菌株对药物的敏感性中的应用。本发明提供了一种构建重组菌的方法。本发明提供的方法，为抑制或降低大肠杆菌中pncA基因和nadC基因的表达或活性，且提高所述大肠杆菌中碱性磷酸酶基因的表达或活性，得到重组菌。本发明的实验证明了，本发明构建的重组菌，向NAD营养缺陷型菌株中引入了一个碱性磷酸酶(EAP)的表达质粒，利用EAP显色原理来检测共培养体系内大肠杆菌的生长状态，颜色反应方法在保证检测效果的前提下，肉眼即可判读样品对抗结核药物的耐药性，操作更为简便。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种重组菌及其在检测结核分枝杆菌菌株对药物的敏感性中的应用。

背景技术

结核菌药物敏感性的准确、快速分析，是临床及时制定适当化疗方案的前提条件，是制约结核病及时有效治疗的瓶颈之一。科学家们为此进行了不懈努力，但迄今为止，结核菌临床药敏分析仍然停留在耗时的基于结核菌培养的传统药敏分析方法，尽管随着分子生物学技术的进步，科学家们开发了多种分子生物学分析手段，但这些貌似先进的手段在准确性方面先天性不足，目前还没有迹象表明它们能够代替传统的分析方法。

BACTEC MGIT960全自动培养系统是集分枝杆菌快速生长培养、检测、药敏技术为一体的全自动分枝杆菌培养仪，具有无交叉污染、无放射、连续监测标、准确的数据处理系统等优点，能快速、敏感、高效的分析分枝杆菌对药物的耐药结果，缩短了报告结果时间，但其仪器耗材昂贵，成本高，短时间很难大范围推广，特别是基层医疗单位更难以推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建重组菌的方法。

本发明提供的方法，为抑制或降低大肠杆菌中pncA基因和nadC基因的表达或活性，且提高所述大肠杆菌中碱性磷酸酶基因的表达或活性，得到重组菌。

上述方法中，所述抑制或降低大肠杆菌中pncA基因和nadC基因的表达或活性为敲除大肠杆菌中的pncA基因和nadC基因；

所述提高大肠杆菌中碱性磷酸酶基因的表达或活性为将碱性磷酸酶基因导入所述大肠杆菌中。

上述方法中，所述敲除是采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；

或所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑；

或所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组；具体方法见实施例。

或所述导入是通过表达碱性磷酸酶基因的重组载体导入。

上述方法中，所述碱性磷酸酶基因来自大肠杆菌。

上述方法中，所述pncA蛋白的氨基酸序列为序列4；

或，所述nadC蛋白的氨基酸序列为序列2；

或，所述碱性磷酸酶的氨基酸序列为序列6；

或，所述pncA基因的核苷酸序列为序列3；

或，所述nadC基因的核苷酸序列为序列1；

或，所述碱性磷酸酶基因的核苷酸序列为序列5。

上述方法中，

所述敲除大肠杆菌基因组中的pncA基因采用λ-red同源重组方式；

或，所述敲除大肠杆菌基因组中的nadC基因采用λ-red同源重组方式；

或，所述表达碱性磷酸酶基因的重组载体为将碱性磷酸酶基因EAP插入表达载体，得到重组质粒。

上述方法中，

所述大肠杆菌为E.coli W3110。