[发明专利]一种脐带血NK细胞的培养方法

说明书

本发明涉及细胞培养领域，特别涉及一种脐带血NK细胞的培养方法，包括以下步骤：由脐带血分离得到的PBMC细胞接种于包被有CD16单抗的培养容器中培养，培养体系是在VIVO‑15基础培养基的基础上添加FBS、IL‑2、IL‑12、IL‑15；培养4‑4.5天后，扩培，扩培接种于包被有CD16单抗的培养容器中培养，扩培所用的培养体系是在GT‑T581基础培养基的基础上添加FBS、IL‑2、IL‑7、IL‑12、IL‑15、IL‑21。本发明提供的脐带血NK细胞的培养方法，通过在不同的基础培养基上添加不同的组分进行初始培养和扩培，操作简便，成本低，能得到大量满足临床使用标准的NK细胞，使该方法更利于推广和应用。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体而言，涉及一种脐带血NK细胞的培养方法。

背景技术

NK细胞又称为自然杀伤细胞，属于大颗粒淋巴细胞，来源于骨髓，分布于外周血、肝脏及脾脏，少量分布于淋巴结及其他组织中，占外周血淋巴细胞的5％～15％，是重要的免疫细胞。NK细胞是身体初期防御的重要机构，具有强力的细胞毒活性。同时发挥免疫调节作用，快速提升免疫力和康复质量科学家在1975年首次鉴定到了NK细胞，这类细胞能够在缺少T、B细胞的情况下直接杀伤肿瘤细胞。与具有细胞毒性的CD8+T细胞不同，NK细胞杀伤肿瘤细胞时不需要预先致敏可以直接杀伤MHC阴性的肿瘤细胞，这使得NK细胞在过继细胞免疫治疗中被广泛应用。但NK细胞在外周血淋巴细胞中所占的比例较低，所以有必要建立一种NK细胞体外扩增技术，用于研究NK细胞的功能并为肿瘤的细胞免疫治疗奠定基础。

近年来，有人采用基因工程的方法在K562细胞上同时表达IL-15、CD137L等分子,并以此细胞来刺激NK细胞的增殖。或者使用磁珠筛选CD56-细胞等方法培养NK细胞。上述方法在操作条件和成本上都较高，为NK细胞的临床使用造成了一定的困难。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脐带血NK细胞的培养方法，操作简便，成本低，能得到大量满足临床使用标准的NK细胞，使该方法更利于推广和应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种脐带血NK细胞的培养方法，包括以下步骤：

由脐带血分离得到的PBMC细胞接种于包被有CD16单抗的培养容器中进行培养，培养体系是在VIVO-15基础培养基的基础上添加以下组分：以培养体系的体积计，FBS 50±2μL/mL，IL-2 500±10IU/mL，IL-12 2.5±0.2ng/mL，IL-15 20±2ng/mL；

培养4-4.5天后，进行扩培，扩培接种于包被有CD16单抗的培养容器中进行培养，扩培所用的培养体系是在GT-T581基础培养基的基础上添加以下组分：以培养体系的体积计，FBS 50±2μL/mL，IL-2 500±10IU/mL，IL-7 1ng±0.1ng/mL，IL-12 2.5±0.2ng/mL，IL-15 50±2ng/mL，IL-21 2ng±0.2；

所述扩培次数至少一次。

本发明提供的脐带血NK细胞的培养方法，通过在不同的基础培养基上添加不同的组分进行初始培养和扩培，操作简便，成本低，能得到大量满足临床使用标准的NK细胞，使该方法更利于推广和应用。

进一步地，所述包被有CD16单抗的培养容器均采用以下方法制备：

以所述培养面积为25cm²计，加入含有3±1μg的CD16单抗和1±0.2mL的D-PBS，在细胞培养条件下包被3.5h～4.5h。

进一步地，PBMC细胞培养的密度为0.5×10⁶/mL-2.0×10⁶/mL。