[发明专利]一种金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用有效位点的筛选方法

权利要求书

1.一种金花茶中黄酮类物质对鼻咽癌作用有效位点的筛选方法，其特征在于包括如下具体步骤：

1)金花茶中的黄酮类物质的提取

金花茶花朵浓缩液制备：采摘秋季新鲜的金花花朵，筛选、洗净、粉碎，将粉碎后的金花茶花朵0.8-1.2公斤；加入95％以上的乙醇2.0L，利用索氏提取器提取5-6h，得提取液A；提取后残渣加入95％以上的丙酮1.0-1.8L，在40-60℃条件下超声1-2h，得提取液B，合并提取液A和B，利用旋转蒸发仪旋转蒸发除去丙酮或乙醇溶剂，得到有机相的金花茶花朵浓缩液0.2-0.3L；

四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料制备过程：在氮气保护下，pH＝1.7时，制备0.085mol/L的三氯化铁溶液和0.05mol/L的硫酸亚铁的混合物；往此混合物中滴加1.5mol/L的氨水溶液，并剧烈搅拌，直至pH＝9；所获得的四氧化三铁磁性纳米粒子立即用水洗涤5次，然后用甲醇洗涤3次，磁分离把四氧化三铁磁粒子分散于甲醇之中，获得的分散液浓度为0.0128mol/L；上述制备的25mL的四氧化三铁磁粒子的甲醇溶液，用甲醇稀释至150mL，并超声处理30min；然后加入10mL的3-胺丙基三甲氧基硅烷，强烈搅拌并超声处理7h；所得溶液用甲醇洗涤5次后进行磁分离，分散于甲醇获得5wt％的溶液备用；取50mL的5wt％的四氧化三铁磁粒子甲醇溶液为起始溶液，加入200mL含有丙烯酸甲酯的甲醇溶液，丙烯酸甲酯的体积浓度为20％，把此混合液在室温水浴中超声7h；然后用磁铁收集磁性纳米粒子，随后用甲醇洗涤5次，并磁分离；在洗涤之后，向该磁性纳米粒子的甲醇溶液中加入40mL含有乙二胺的甲醇溶液，乙二胺的体积浓度为50％，室温下超声处理3h；然后用甲醇洗涤该磁性纳米粒子5次，并进行磁分离；重复地加入丙烯酸甲酯和乙二胺的甲醇溶液，循环四次得到四代树形分子修饰的四氧化三铁磁粒子；此溶液用25mL甲醇洗涤3次，并用25mL水洗涤5次，磁分离收集获得PAMAM树形分子修饰的四氧化三铁磁粒子，即四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料；

将制备得到的四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料2-3g加入到第一步制备好的0.2-0.3L金花茶花朵萃取液中，在400W条件下超声萃取1h，萃取结束后通过磁分离手段将吸附萃取黄酮类物质的四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料分离，分离后的吸附有黄酮物质的四氧化三铁磁粒子-PAMAM复合材料采用有机溶剂乙醇萃取3-5次，合并萃取液，旋转蒸发得到金花茶中的黄酮类物质；

2)体外培养的鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2、CNE-2Z、HNE-2、C666-1、NP29、5-8F和6-10B，上述细胞均贴壁生长于RPMI 1640培养基中，在37℃、5％的CO₂、饱和湿度下传代培养。

实验分组：黄酮组、阳性对照组，溶剂对照组和空白对照组，其中黄酮组中黄酮各剂量组分别为10、20、30、50和90μmol/L；阳性对照组顺铂用药剂量为0.25μmol/L；溶剂对照组加入终浓度为0.1％的DMSO；空白对照组仅加入等体积培养液，不加药物和细胞；

3)检测黄酮类物质对鼻咽癌细胞的作用

a)采用MTT法检测黄酮类物质对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用，用流式细胞仪分析细胞周期，具体步骤包括取对数生长期CNE-1、CNE-2、CNE-2Z、HNE-2、C666-1、NP29、5-8F和6-10B中的一种或两种以上，经质量百分比浓度为0.25％的胰酶消化，接种于96孔培养板内，5×10³个细胞/孔，预培养24h，待细胞贴壁后吸出全部上清，按实验分组加入不同浓度的各种受试物，总体积200μl/孔，每一剂量组设4个复孔；分别培养24、48、72和96h，每孔加入20μl浓度为5mg/L的MTT，继续培养4h，弃去培养液，每孔加200μl的DMSO，平板摇床摇震10min，以DMSO调零，用酶联免疫检测仪以490nm波长测定各孔吸光值A，计算平均A值、增殖率PR及抑制率CIR；增殖率PR＝(实验组A值/溶剂对照组A值)×100％；抑制率CIR＝(1-试验组平均A值/对照组平均A值)×100％；运用曲线回归分析，求出剂量反应关系方程及回归系数；

b)根据MTT比色法的结果，选取合适的浓度按照实验设计处理细胞；取对数生长期的鼻咽癌细胞，调整密度2.5×10⁴个/mL，置28cm²培养瓶中，培养24h待细胞贴壁后加入不同浓度处理因素，于96h终止培养；取步骤a)中的细胞，弃去培养液，质量百分比浓度为0.25％的胰酶消化，2000r/min离心l0min，弃上清液，将细胞沉淀重悬于PBS液中，调整细胞密度至1×10⁶个/m1，2000r/min离心l0min，弃上清液；快速加入4℃预冷的75％乙醇1ml，使细胞重悬，4℃下保温10-15h；取单细胞悬液lml，加入l0μg/ml的荧光染料碘化丙啶10μl和l0mg/ml的RNA抑制剂5μl，轻微振荡、室温下避光孵育20min，以400目筛网过滤，取细胞悬液在488nm波长下，用流式细胞仪进行细胞DNA含量检测；经Muticycle AV软件处理获取数据，对细胞周期各时相分布百分比进行分析，计算细胞周期中G₀/G₁期、S期和G₂/M期细胞在总数中所占的百分比，以增殖指数PI表示细胞的增殖活性；

c)采用荧光倒置显微镜观察细胞形态学变化：将各细胞接种于96孔板内，5×10³个细胞/孔，预培养24h，各实验组分别加入10、20、30、50、90μmol/L的金花茶黄酮类物质活性提取物，于溶剂对照组、顺铂组分别培养24、48、72和96h，苏木精-伊红染色法染色涂片后于荧光倒置显微镜下观察；

d)应用免疫组化、Real-time荧光定量RT-PCR、Westem-blot分析癌细胞中蛋白表达变化，三株鼻咽癌细胞接种于9孔细胞培养板中，培养24h，经80μmol/L的黄酮物质作用24h后，每5-10×10⁶细胞，加1mL的Trizol试剂，15-30℃作用15min，弃上清液，向沉淀物中加0.5ml异丙醇/ml Trizol试剂，15-30℃作用10min，2-8℃，12000转离心15min，弃上清液；再加入1ml的75％乙醇/ml Trizol试剂洗涤RNA，2-8℃，7500转离心5min，弃上清液，得到的样品于-80℃下保存；

使用ABI/9700系统进行各基因PCR扩增反应，反应程序如下：95℃，10s；预变性：95℃，5s；60℃，34s；40个循环；各种基因的PCR反应均进行扩增产物的熔解曲线分析。后续采用Western-Blot分析鼻咽癌细胞中蛋白表达变化，三株鼻咽癌细胞接种于9孔细胞培养板中，培养24h，经80μmol/L的金花茶黄酮物质作用24h后，PBS液洗涤三次，加入冷的细胞裂解液冰上作用30min，刮取细胞于微量离心管上，4℃，14000转离心15min，吸取上清液，紫外分光光度计测定各样品总蛋白浓度，并调节浓度一致；样品经10-12％聚丙烯酰氨凝胶电泳4h后，转印到硝酸纤维素膜上，100mA、20-60min；硝酸纤维素膜经封闭液封闭3h后，TBS缓冲液洗涤三次，于稀释比例1:500-1:2000的第一抗体工作液中孵育2h；TBS缓冲液洗涤3次，稀释比1:2000的辣根过氧物酶标记的第二抗体工作液孵育2h，TBS缓冲液洗涤3次，超敏发光也显光，感光X光片后，显影定影，β-actin蛋白作为内参蛋白；

4)采用SPSS19.0统计软件对结果进行分析，多样本均数间比较用单因素方差分析；两两比较用LSD检验；剂量反应关系用曲线回归和相关分析，检验水准α＝0.05；

5)检测黄酮物质作用鼻咽癌细胞后的差异表达蛋白，获得双向电泳差异表达图谱，鉴定差异蛋白的肽指纹图谱，经数据库匹配，筛选出相关蛋白，所述相关蛋白包括bcl-2，notch1，nm23-H1，bax和E-cadherin。