[发明专利]猪圆环病毒3型Cap重组蛋白及其编码基因和应用

说明书

本发明公开了一种猪圆环病毒3型Cap重组蛋白及其编码基因和应用，本发明采用PCR方法将PCV3 Cap基因中表达第1‑120aa或60‑120aa的基因片段删除，得到了PCV3 Cap重组蛋白的编码基因，将该编码基因克隆至pET32a，再转化至Rosseta感受态细胞，经IPTG诱导表达，可以得到PCV3 Cap重组蛋白。该蛋白呈可溶性表达，可与His标签抗体结合，采用亲和层析方法便于纯化。采用该重组蛋白对猪进行免疫，可以得到多克隆抗体，该多克隆抗体效价高，与PCV3有相似的抗原性。以该重组蛋白包被酶标板，对PCV3进行间接ELISA抗体检测，具有敏感性、特异性和重复性好等优势。

技术领域

本发明涉及一种猪圆环病毒3型Cap重组蛋白及编码该蛋白的基因，还涉及采用所得的猪圆环病毒3型Cap重组蛋白进行PCV3间接ELISA抗体检测的应用。

背景技术

猪圆环病毒病由猪圆环病毒引起，猪圆环病毒(PCV)分为三个血清型，PCV1、PCV2以及PCV3。普遍认为PCV1对动物没有致病性。目前，病毒感染特性和致病性研究最清楚的是PCV2，PCV2对养猪业造成的危害十分严重，可以引起圆环病毒相关疾病(PCVAD)，造成免疫抑制。PCV2主要有两个阅读框：ORF1和ORF2，ORF1表达Rep蛋白和剪切体Rep’，ORF2编码病毒的Cap蛋白，Cap蛋白构成病毒核衣壳的主要成分，是病毒的主要结构蛋白，决定病毒的抗原性，还可以自我组装形成病毒样颗粒。ORF2基因是疫苗开发和病原检测主要的靶蛋白，同时也是各亚型之间存在主要差异的基因。2016年美国学者Rachel Palinski等报道了一种新型病毒PCV3，随后该病毒在亚洲、美洲、欧洲等很多国家和地区出现。PCV3基因组长2000bp，ORF1编码Rep蛋白，长度297aa(氨基酸)，ORF2编码Cap蛋白，长度214aa(氨基酸)。PCV3可以引起PDNS，并且表现出与PCV2类似的繁殖障碍、多系统性炎症等症状。湛洋对PCV3Cap蛋白结构进行了分析，发现其与PCV2Cap蛋白结构不存在共同的线性表位。还有研究表明，PCV3ORF2基因和PCV2的ORF2基因表现出较大的差异，同源性仅37％左右，因此预测，PCV2疫苗对PCV3可能没有交叉保护作用。

基于以上原因，目前PCV2疫苗以及PCV2的检测方法都不能直接适用于PCV3，需要针对PCV3ORF2基因的特异性研究适合它的检测方法和疫苗。临床上常使用血清学监测的方法了解抗体或者病原在动物体内的分布情况。间接免疫荧光实验和免疫过氧化物酶单层细胞试验操作复杂，成本昂贵，对设备要求高，不适用于临床大规模检测。ELISA方法不仅可以简便地对猪群感染情况进行监测，还可以用于评价疫苗的免疫效果，在ELISA方法中，包被抗原的浓度及纯度是影响检测结果敏感性和特异性的关键，因此研究PCV3Cap蛋白的可溶性表达及纯化，得到适合于PCV3检测的ELISA方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种猪圆环病毒3型Cap重组蛋白的编码基因，该编码基因是将PCV3ORF2(开放式阅读框)基因的表达第1-120位氨基酸或第60-120位氨基酸的基因片段删除后得到的，该基因成功实现了猪圆环病毒3型Cap重组蛋白的可溶性表达，即实现了PCV3Cap重组蛋白的可溶性表达。

PCV ORF2基因编码Cap蛋白，Cap蛋白是该病毒的重要结构蛋白，决定了病毒的抗原性，是疫苗免疫靶向的主要抗原。大肠杆菌表达系统具有目的蛋白表达效率高、操作简单、成本低等特点，其缺点是目的基因性质容易影响载体的表达，特别是目的基因的跨膜区、信号肽，可能使目的蛋白无法表达。本发明经过研究，通过将疏水性较强、抗原性较弱的PCV3ORF2基因的表达第1-120位氨基酸或第60-120位氨基酸的基因片段截短，实现了目的蛋白高效表达，而且，目的蛋白呈可溶性表达。目的蛋白基因的末端融合表达His标签，可利于采用镍柱亲和层析纯化目的蛋白。