[发明专利]一种具有杀线杀虫活性的耳霉胞质可溶性提取物及其用途

说明书

一种具有杀线杀虫活性的耳霉胞质可溶性提取物及其用途，属于农药技术领域。采用以下方法制备：1)耳霉真菌活化；2)液体摇菌培养；3)菌丝细胞破壁；4)可溶性胞质蛋白提取。上述一种耳霉胞质可溶性提取物，具有优良的杀虫杀线活性，最优条件下对大蜡螟幼虫和松材线虫成虫致死率达到了100％和96.4％，且制备简单，可应用于农林害虫防治。

技术领域

本发明属于农药技术领域，具体为一种具有杀线杀虫活性的耳霉胞质可溶性提取物及其用途。

背景技术

农林作物常年受到不同种类的病虫害侵蚀，产量损失巨大。其中，线虫种类繁多，大多数为寄生物，种类超过1万种，包括主要农林作物及动物的病原体，例如危害农作物的根结线虫和引发松林大片死亡的松材线虫，这些病原线虫给农业和林业产业发展都构成了巨大威胁。目前普遍采用化学农药的方法进行防治，但受环境保护的要求，有些杀线剂逐步被淘汰，如高毒的呋喃丹。因此，有必要开发对环境友好地生物源杀线虫剂。目前研究较多的是苏云金杆菌来源的具有杀线活性的cyt毒素，但制备比较复杂。农林业害虫的防控工作也存在同样的问题，避免长期使用化学农药带来的抗药性、环境污染等问题。

耳霉属真菌(Conidiobolus)为真菌界中进化较原始的虫霉门(Entomophthoromycota)真菌。正如虫霉多为昆虫病原真菌，耳霉属真菌大多数都具有感染昆虫纲节肢动物的能力，主要通过弹射侵染性分生孢子直接穿透寄主体壁来感染昆虫，对刺吸式口器害虫尤为有效，而且其又能在寄主种群内诱发流行病，对压制虫害爆发具有作用，是一类重要的生物防治用菌资源。该属真菌不同种类的寄主范围也有所不同，例如冠状耳霉寄主范围广，对鳞翅目等害虫具有感染能力，而暗孢耳霉仅在自然条件下感染蚜科害虫，这一差别往往取决于其所能产生的功能蛋白酶种类差异。虫霉致死寄主昆虫涉及到多种水解酶的作用，如类枯草杆菌素丝氨酸蛋白酶，类胰蛋白酶、脂肪酶、几丁质酶等，通过多种水解酶共同作用来瓦解寄主昆虫的组织屏障，侵染到寄主各部分，并大量吸收寄主体内各种养分，导致寄主因自身营养耗竭死亡，最后寄主成只具外形的僵尸，体内已被病原真菌菌丝占据。虫霉基因组中所含的水解酶编码基因资源丰富，且具有菌种特异性，也就是说不同菌种能产生多种不同水解能力的功能蛋白，对于寄主而已，这些水解酶具有毒力，能崩解其组织，杀死昆虫。另外，耳霉属真菌(暗孢耳霉)被发现有高表达编码独特的类cyt昆虫毒素的功能基因，杀线试验中表现有致死松材线虫的能力。

虫霉包括耳霉属昆虫病原菌的这种致死寄主的方式，是虫霉与昆虫之间你死我活的一种生态关系，是长期共同进化的结果，存在高度的专一性，对周围环境和其它生物无影响，具有绿色安全的价值。虫霉类昆虫病原真菌不同于白僵菌等丝孢类真菌，产生的分生孢子数量有限，很难进行规模化生产，限制了这类宝贵真菌资源的实际应用。大量研究表明，发挥关键作用的是其产生各种杀虫活性的蛋白，因此有必要从虫霉产的功能蛋白的角度来开展应用。耳霉属真菌相较于其它种类虫霉具有生长速度快，培养要求低等优点，适宜进行后期规模化生产要求。但杀虫杀线活性蛋白的产生与菌体生长并不同步，最适宜的培养条件并不代表功能蛋白产出的最适条件。基于此，探索耳霉属真菌含杀虫杀线活性蛋白的胞质提取物的制备条件成为其应用的前提。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种具有杀线杀虫活性的耳霉胞质可溶性提取物及其用途的技术方案，其可快速获取具有高效杀线杀虫活性的耳霉胞质提取物，其技术体系可借鉴到后续的扩大生产应用中。

所述的一种具有杀线杀虫活性的耳霉胞质可溶性提取物，其特征在于采用以下方法制备：

1)耳霉真菌活化；

2)液体摇菌培养：活化的耳霉真菌在23-25℃暗培养4-6天，挑取新鲜菌块加入到萨氏液体培养基中，所述的萨氏液体培养基由质量浓度为2-12％葡萄糖、0.9-1.1％酵母粉、0.9-1.1％蛋白胨制成，新鲜菌块与萨氏液体培养基的重量体积比为1mg：0.8-1.2ml，16-30℃，190-210rpm转速下摇菌培养1-5天，得到发酵菌液；