[发明专利]一种非洲猪瘟EP153R与P54基因共表达的重组腺病毒载体构建及腺病毒包装方法

权利要求书

1.一种非洲猪瘟病毒EP153R与P54基因共表达重组腺病毒载体，其特征在于，以pShuttle-CMV真核表达载体为基础，在多克隆位点处引入CTLA4、EP153R、P54基因以构建重组腺病毒载体pAD-Shuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54；所述CTLA4基因、EP153R基因、P54基因分别具有如序列表中Seq ID No.1、Seq ID No.2 、Seq ID No.3所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒EP153R与P54基因共表达重组腺病毒载体，其特征在于，所述多克隆位点为KpnI和HindIII的酶切位点。

3.一种非洲猪瘟病毒EP153R与P54基因共表达重组腺病毒载体的构建方法，包括以下步骤：

1)针对EP153R基因、P54基因，通过人工合成，获取优化后的基因片段，并分别在EP153R基因、P54基因序列两端添加相应的酶切位点与同源区；CTLA4基因序列两端添加相应的酶切位点与同源区；

2）用限制性内切酶KpnI和HindIII对pShuttle-CMV载体进行双酶切，得到线性化pShuttle-CMV载体；

3）将所述步骤2）得到的线性化pShuttle-CMV载体与CTLA4-EP153R、P54进行同源重组，得到pShuttle-CMV-CTLA4-EP153R- P54真核表达质粒，使用CMV-F与SV40-R进行测序；

4)将所述步骤3）得到的pShuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54真核表达质粒进行瞬时表达，标签蛋白验证蛋白表达；

5）将所述步骤3) 得到的pShuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54真核表达质粒进行PmeI酶切，转化入BJ5183大肠杆菌进行重组，得到共表达腺病毒载体pAD-Shuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54。

4.一种重组腺病毒包装方法，其特征在于，将权利要求1所述的pAD-Shuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54共表达腺病毒载体用PacI进行单酶切，线性化后的质粒用于转染；转染293A细胞，实现重组腺病毒包装。

5.根据权利要求4所述的一种重组腺病毒包装方法，其特征在于，由以下步骤制备得到：

1）将pAD-Shuttle-CMV-CTLA4-EP153R-P54真核表达质粒用PacI进行单酶切，线性化后的质粒用于转染；使用Lip3000转染试剂转染293A细胞；

2）转染后至细胞脱落较多，收集细胞及上清，即为P1代腺病毒；

3）P1代腺病毒感染293A细胞，观察细胞状态。

6.权利要求4或5所述的重组腺病毒包装方法制备得到的重组腺病毒。

7.包含权利要求6所述的重组腺病毒的疫苗。