[发明专利]一种非洲猪瘟EP153R与P54基因共表达的重组腺病毒载体构建及腺病毒包装方法

说明书

本发明提供了一种非洲猪瘟EP153R与P54基因共表达的重组腺病毒载体构建及腺病毒包装方法，属于基因工程技术领域。一种EP153R基因与P54基因过表达腺病毒载体，以pShuttle‑CMV真核表达载体为基础，在多克隆位点处引入CTLA4、EP153R、P54基因。本发明还提供了共表达EP153R、P54基因的重组腺病毒，利用构建得到的pAD‑Shuttle‑CMV‑CTLA4‑EP153R‑P54载体实现腺病毒包装过程，得到能够直接感染动物或真核细胞的腺病毒，从而实现了EP153R与P54基因在真核细胞中共表达的目的，为研究实现EP153R与P54基因共表达的腺病毒疫苗奠定了基础。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉一种非洲猪瘟病毒CTLA4、EP153R、 P54基因共表达重组腺病毒载体、构建方法及腺病毒包装方法。

背景技术

非洲猪瘟(african swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病。其特征为病程短、病死率高、临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，表现高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血。ASFV是一种直径为200nm的正二十面体病毒，病毒含有直径70～100nm DNA 核心，外周是直径172～191nm二十面体的衣壳和含类脂的囊膜。ASFV基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，大小170～190kb(随毒株的不同而有差异)，末端交互连接，有末端倒置重复序列。基因组可以编码150～200种蛋白质，编码这些蛋白质的许多基因已被克隆和表达。

CTLA4(cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4)基因(NC_010457.5)即细胞毒性T细胞相关抗原-4：属于免疫球蛋白超家族,主要在活化的CD4+和 CD8+T细胞以及激活的B细胞表面表达。CTLA-4可与CD28分子竞争结合T 细胞上的B7分子,且其亲合力是CD28的10～50倍,因此是免疫应答负调节的主要表面吸附分子，可作为抗原递呈细胞的靶向分子，诱导强烈的体液和细胞免疫。

EP153R基因(GI：22220439)全长474bp，编码产生158个碱基组成的跨膜蛋白，与CD44分子的N端区域有显著的同源性，包含N-糖基化位点、磷酸化作用位点、酰化作用位点、中央跨膜区、c型动物凝集结构域、细胞附着序列。 EP153R基因主要在病毒感染的早期与晚期，据报道，EP153R基因可诱导或保持病毒CD2同源物与其相应受体的结合；EP153R基因的C型动物凝集结构域对MHC-I类抗原表达具有抑制作用；EP153R基因的存在使病毒感染或星形孢菌素处理Vero细胞中P53蛋白的转录活性降低，这是第一个描述具有抗凋亡特性的c型动物凝集素。构建表达EP153R基因的重组腺病毒载体能够更好的研究基因功能，为研发非洲猪瘟候选疫苗提供技术支持。

P54蛋白是ASFV的Ⅰ型跨膜结构蛋白，由E183L(GI:290782550)基因编码，在病毒的复制过程中起重要作用，参与该病毒对细胞的吸附和侵入，能引起宿主细胞凋亡，在病毒变形和感染早期起重要作用。P54蛋白可生成二硫键，在 ASFV转染细胞时，形成包膜前体，通过靶向定位内质网膜进行蛋白表达，损伤细胞，P54抗体可中和P54蛋白，部分阻断ASFV的侵入，减轻宿主细胞的损伤。

而目前，现有技术中没有CTLA4、EP153R、P54基因共表达的重组腺病毒载体。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明的目的在于提供一种非洲猪瘟病毒EP153R与P54 基因共表达的重组腺病毒、构建方法及腺病毒包装方法，为研究非洲猪瘟抗体奠定技术基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：