[发明专利]拟南芥FIPV启动子融合GUS基因的表达载体构建方法

说明书

本发明是一种拟南芥FIPV启动子融合GUS基因的表达载体构建方法，以拟南芥Col‑01周大的植株为材料，采用CTAB法提取其基因组DNA(gDNA)，设计特异性引物(F和R)扩增FIPV基因启动子，以提取的gDNA为模板，设计的F和R为特异性引物，进行PCR反应再经过酶切，与Gateway兼容的载体pENTR 3C进行连接，构建克隆载体pENTR FIPV‑Promoter，然后将pENTR FIPV‑Promoter与包含GUS报告基因的载体pMDC162进行LR反应，得到FIPV‑Promoter融合GUS的表达载体pMDC FIPV‑Promoter‑GUS。

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种拟南芥FIPV启动子融合GUS基因的表达载体构建方法。

背景技术

植物能够吸收土壤中的NO₃^-、NH₄⁺和有机氮，绝大多数的陆生植物吸收氮素以NO₃^-形式为主。大量的研究表明，NO₃^-不但是一种营养元素，而且还是一种信号分子，在植物短期和长期生长与发育过程中起重要作用。短期效应主要体现在硝态氮初级响应，即施加NO₃^-时植物体内有超过1000多个基因的表达迅速发生变化，比如NRTs,NIAs和NiR在NO₃^-处理几分钟内被诱导表达。长期效应表现在NO₃^-影响植物根系形态建成、种子休眠、开花、生物钟和不依赖于ABA的气孔关闭和生长素运输等过程。近十年来，一些重要的参与NO₃^-初级响应过程并影响NO₃^-代谢过程的调控基因被鉴定。这些调控基因包括转运蛋白类，如NRT1.1；蛋白激酶类，如CIPK8和CIPK23；转录因子类，如NLP7、TGA1、TGA4、TCP20、NRG2等；microRNA类，如micR167。最近的研究表明，参与真核生物mRNA前体3’末端加工的多聚腺苷酸化复合体(CPSF)在调控硝态氮信号途径中起重要作用。FIPV是CPSF的关键成员，极有可能调控植物的硝态氮感知、吸收、转运和同化等过程。因此鉴定该基因的功能对于研究植物硝态氮代谢过程，进而提高植物氮素利用率非常重要。

真核生物的启动子是调控基因表达的关键顺式作用元件，一般位于结构基因的5’端上游。一个典型的启动子包含CAAT-BOX和TATA-BOX，为RNA聚合酶II提供识别和结合位点。由于植物结构基因在基因组中的位置不同，上游很可能存在其他基因的外显子或某些特殊序列，因此植物基因的启动子长度一般差异很大。对植物基因启动子的研究是解析基因转录调控和基因表达模式的关键环节，也是对基因进行功能鉴定的首要步骤。在研究工作中，常需要将基因启动子与GUS(β-葡萄糖苷酸酶)报告基因融合构建表达载体。该表达载体转化植物后，如加入GUS的底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)后，则转基因植物会在该启动子驱动的GUS表达部位与底物发生反应从而生成蓝色产物。根据蓝色产物的多少和产生位置，可以鉴定启动子转录效率和表达模式。因此，要研究FIPV Promoter的转录活性和表达模式，必须建构含有FIPV Promoter融合GUS报告基因的表达载体。

发明内容

本发明的目的是提供一种拟南芥FIPV启动子融合GUS基因的表达载体构建方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明是一种拟南芥FIPV启动子融合GUS基因的表达载体构建方法，包括拟南芥FIPV基因启动子的DNA序列如序列表中拟南芥Col-0FIPV基因启动子序列，拟南芥FIPV基因启动子的克隆方法如下：

1)以拟南芥Col-01周大的植株为材料，采用CTAB法提取其gDNA，设计特异性引物(F和R)扩增FIPV基因启动子：