[发明专利]用于基因检测的FFPE参考品、其制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种用于基因检测的FFPE参考品、其制备方法及应用。该制备方法包括以下步骤：S1，对肿瘤细胞系进行细胞培养，收集细胞沉淀；S2，对细胞沉淀进行福尔马林固定，然后用琼脂糖凝胶包裹形成细胞团块，将细胞团块制作成细胞蜡块；S3，提取细胞蜡块中肿瘤细胞系的基因组DNA，并对肿瘤细胞系的基因组DNA进行基因突变频率测定；S4，把含有目标突变位点的肿瘤细胞系的基因组DNA混合成目标突变频率的DNA混合物，DNA混合物即为用于基因检测的FFPE参考品。应用本发明的技术方案，对肿瘤细胞系培养的细胞进行福尔马林固定石蜡包埋，可以更好地模拟临床样本的情况。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及一种用于基因检测的FFPE参考品、其制备方法及应用。

背景技术

近年来，基因检测领域发展极为迅速，涉及癌症的早期筛查、诊断、辅助治疗及其它疾病个体化治疗的检测、分析等方面。目前主要使用的检测方法有二代测序、ARMS PCR、ddPCR技术等，相应地，市场上出现了很多此类基因检测试剂盒。

基于临床的基因检测试剂盒在研发过程中都需要用到参考品，参考品是验证和评价试剂盒检测的准确性、稳定性等性能的重要方法和指标。

临床样本多为福尔马林固定石蜡包埋的样本(FFPE样本，Formalin-Fixed andParaffin-Embedded样本)，而目前常见的参考品多是新鲜细胞制备的基因组DNA，不能很好地模拟临床样本的情况。虽然一些临床样本也被用来作为参考品，但是临床样本的稀有性及肿瘤组织的异质性导致很难收集到足够的有固定突变频率的临床样本进行大规模、多次重复验证，同时，单一临床样本的突变位点往往较为单一，不能满足检测试剂盒验证时同时验证多个目标基因位点的需求。

市场上没有稳定、有效、通用的福尔马林固定石蜡包埋标准品，这是亟待解决的问题。

发明内容

本发明旨在提供一种用于基因检测的FFPE参考品、其制备方法及应用，以解决现有技术中临床FFPE样本作为参考品数量少、频率及位点不固定的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种用于基因检测的FFPE参考品的制备方法。该制备方法包括以下步骤：S1，对肿瘤细胞系进行细胞培养，收集细胞沉淀；S2，对细胞沉淀进行福尔马林固定，然后用琼脂糖凝胶包裹形成细胞团块，将细胞团块制作成细胞蜡块；S3，提取细胞蜡块中肿瘤细胞系的基因组DNA，并对肿瘤细胞系的基因组DNA进行基因突变频率测定；S4，把含有目标突变位点的肿瘤细胞系的基因组DNA混合成目标突变频率的DNA混合物，DNA混合物即为用于基因检测的FFPE参考品。

进一步地，S4包括：S41，把含有目标突变位点的肿瘤细胞系的基因组DNA进行预混合得到DNA预混合物，测定得到DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率；S42，将DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率与目标突变频率进行比较；S43，如果DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率等于目标突变频率，则DNA预混合物即为用于基因检测的FFPE参考品；如果DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率与目标突变频率不一致，则根据DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率的检测结果进一步细化调整混合比例，重复S41和S42直到得到的DNA混合物的目标突变位点基因突变频率与目标突变频率一致，获得用于基因检测的FFPE参考品。

进一步地，S43包括：采用目标突变位点基因突变频率为0的FFPE阴性细胞系DNA稀释用于基因检测的FFPE参考品，进一步得到更低期望目标突变位点基因突变频率的用于基因检测的FFPE参考品；优选的，FFPE阴性细胞系DNA为GM12878细胞系DNA。

进一步地，S43中DNA预混合物的目标突变位点基因突变频率的检测结果为ddPCR和NGS的检测结果。