[发明专利]一种用于检测犬支原体的实时荧光定量PCR方法

权利要求书

1.一种实时荧光定量PCR检测犬支原体的特异引物，其特征在于：

所述上游引物的序列为：5′-AAATCGAACTCGAGGACAACAAT-3′，

所述下游引物的序列为：5′-AGCATCAAAAACAACTTCCTTGC-3′。

2.一种检测犬支原体的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测样品DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，按常规方法进行PCR扩增，将扩增的目的基因片段回收、纯化，连接到pMD-18T载体上，转化，提取质粒DNA，获得犬支原体标准质粒；

(3)将步骤(2)所制备的标准质粒作10倍梯度稀释，以稀释液为模板，以权利1所示的DNA分子为引物，根据已优化的条件和体系进行实时荧光定量PCR扩增，以Ct值为纵坐标，标准质粒拷贝数的对数值为横坐标，制作标准曲线如图1所示；

(4)将待测样品DNA稀释至步骤(3)所得标准曲线范围内；以权利1所示的引物进行实时荧光定量PCR扩增，得Ct值，然后根据步骤(3)所得标准曲线计算出目标片段的拷贝数；

(5)所述的方法判定阳性或阴性的标准是：实时荧光定量PCR，若检测样品无特征性扩增曲线或Ct值大于31或Tm值不在76.9±0.5℃范围内的，则表明样品为阴性，不含犬支原体；若检测样品出现典型的扩增曲线，且Ct值小于等于31且Tm值为76.9±0.5℃，则表明样品中含有犬支原体。

3.根据权利要求2所述的一种检测犬支原体荧光定量PCR方法，其特征在于，实时荧光定量PCR的10μL反应体系为：

4.根据权利要求2和3所述的方法，其特征在于，进行实时荧光定量PCR扩增时反应条件为：94℃预变性5min，95℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸15s，39个循环，最后72℃延伸7min。