[发明专利]一种用于检测犬支原体的实时荧光定量PCR方法

说明书

本发明提供了一种检测犬支原体的特异引物及实时荧光定量PCR检测方法，属于生物技术领域。本发明根据Genebank公布的犬支原体唾液酸酶基因保守区序列设计特异引物，扩增目的片段，将其连接到pMD‑18T载体，构建重组标准质粒，将其进行10倍倍比稀释，Ct值与拷贝数之间呈良好的线性关系，相关系数为0.9947。该方法灵敏度高，最低检出限为1.85×10⁴拷贝/μL，比普通PCR检测灵敏度提高100倍；特异性好，对常见的3种支原体以及犬常见病原体均无特异扩增曲线；重复稳定性好，组间及组内变异系数均小于0.5％。该方法克服了传统分离培养鉴定时间长、血清学方法易产生交叉反应及常规PCR假阳性的缺陷，可用于犬支原体的早期诊断和检测，对犬支原体病的防控具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种犬病原菌的检测方法，具体涉及一种犬支原体实时荧光定量PCR检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

随着人们生活水平的提高，越来越多的人开始养宠物。据狗民网发布的《2017年中国宠物行业白皮书》，其中宠物犬约占61.74％，约1.5亿只。一只宠物犬一年花费约6000元，宠物医疗约占总费用的30％。

支原体属于细菌界、厚壁菌门、柔膜菌纲、支原体目、支原体科、支原体属的一类缺乏细胞壁、能够独立生存的已知的最小原核微生物。支原体可以感染许多动物，包括犬、禽、猪、反刍动物、人以及爬虫类动物等。支原体的基因组极小，细胞能够自我复制，约0.3-0.8μm，生长需依赖环境中的养分。

犬支原体主要引起犬呼吸道疾病、泌尿生殖道疾病、贫血症、关节炎及结肠炎等。支原体常与其他细菌或病毒混合或继发感染，并加重疾病症状，如不及时治疗会引起病原扩散以及其他组织器官的损伤。研究表明，犬支原体在生殖道感染的检出率雄性犬30％-50％，雌性犬23％-75％，支原体给宠物犬及肉犬养殖业造成巨大的影响，对于长期食用狗肉的人存在潜在危害，所以能够早期诊断犬是否感染支原体尤为重要。

支原体检测方法主要包括分离培养、血清学方法及常规PCR方法等。检测犬支原体最可靠的依据方法是从样本中分离到支原体，但犬支原体的分离耗时、敏感性差，对营养要求极为苛刻，体外培养生长缓慢，耗时较长，容易被其他病原微生物污染，所以传统的分离培养法不能满足临床诊断的需要。血清学检测方法与其他支原体之间存在交叉反应，给犬支原体的鉴别诊断带来了困难。常规PCR检测技术灵敏度不高，容易受到环境的污染，且无法实时监测PCR过程。目前，国内犬支原体相关的研究尚属空白，急需建立一种快速、准确和灵敏度高的检测方法。随着现代分子生物学技术的快速发展，实时荧光定量PCR检测技术填补了以上方法的缺陷，具有灵敏度高，特异性好，样品消耗少，且可以实时直观地检测PCR扩增过程，使它成为应用于检测微生物的有效方法。

鉴于此，本发明拟建立一种快速、敏感及准确定量的方法检测犬支原体，为犬支原体的流行病学调查及疫情预警提供技术支持，对我国养犬业的健康发展及公共卫生安全具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的缺陷，目的在于提供一种检测犬支原体的特异引物及实时荧光定量PCR检测方法。

为实现上述发明目的，本发明所采取的技术方案为：

1.引物设计：根据GeneBank上公布的犬支原体的唾液酸酶基因保守区序列设计特异引物，其核苷酸序列如下：

上游引物：5′-AAATCGAACTCGAGGACAACAAT-3′，

下游引物：5′-AGCATCAAAAACAACTTCCTTGC-3′。

2.实时荧光定量PCR扩增反应体系为：

实时荧光定量反应条件为：94℃预变性5min，95℃变性15s，58℃褪火30s，72℃延伸15s，39个循环，最后72℃延伸7min。