[发明专利]一种人巨细胞病毒IgM抗体检测试纸的制备方法

权利要求书

1.一种人巨细胞病毒IgM抗体检测试纸的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)先制造试纸承载板和试纸；所述的试纸承载板为长条状PVC板，所述的试纸由滴样垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸样垫组成；所述的滴样垫由玻璃纤维膜或无纺布制成，所述的吸样垫由吸水滤纸制成；(2)将所述的滴样垫粘贴于所述的试纸承载板的一端，所述的滴样垫的一端粘接所述的胶体金结合垫，所述的胶体金结合垫的另一端粘接所述的硝酸纤维素膜，所述的硝酸纤维素膜的另一端粘接所述的吸样垫；所述的硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测T线和质控C线，所述的检测T线为抗IgMμ链单克隆抗体，所述的质控C线为人巨细胞病毒pp150-gB-pp65融合蛋白IgM抗体；所述的胶体金结合垫内含有标记人巨细胞病毒特异性的抗原pp150-gB-pp65融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的人巨细胞病毒IgM抗体检测试纸的制备方法，其特征在于：可用pp28(UL99)或gH(gpUL75)替代pp150-gB-pp65融合蛋白中的一种。

3.根据权利要求2所述的人巨细胞病毒IgM抗体检测试纸的制备方法，其特征在于：可在pp150-gB-pp65融合蛋白中增加pp28(UL99)和gH(gpUL75)的一种或两种。

4.根据权利要求3所述的人巨细胞病毒IgM抗体检测试纸的制备方法，其特征在于：所述的试纸的制备方法为以下步骤：

(1)重组基因构建及融合蛋白分离提取，①聚合酶链反应引物，根据目的片段的DNA序列，设计三对引物(P1，P2)，(P3，P4)和(P5，P6)，P1和P2用于扩增pp150基因片段，P3和P4用于扩增gB基因片段,P5和P6用于扩增pp65基因片段,P1和P6引物带有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，P2和P3、P4和P5引物的顺序互补，P2、P3共同对应于pp150上述片段的3’末端和gB上述片段的5’末端序列,P4、P5共同对应于gB上述片段的3’末端和pp65上述片段的5’末端序列；

②目的基因的克隆，取病毒培养液1μl，加入10×Pfu高保真酶缓冲液5μl，浓度2mmol/LdNTPS 5μl，P1、P2引物各2μl，Pfu高保真酶0.5μl，加灭菌双蒸水至50μl并充分混匀；反应条件为变性94℃30s，退火65℃30s，复性72℃60s，进行30个循环，再72℃延伸10min；P3、P4和P5、P6引物克隆方法同上；然后以第一轮PCR扩增得到的pp150片段、gB(UL55)为模板，加入引物P1和P4，扩增pp150-gB片段，反应条件为pp150片段、gB分别为1μl，加入10×Pfu高保真酶缓冲液5μl，浓度2mmol/L的dNTPS5μl，P1、P4引物各2μl，Pfu高保真酶0.5μl，加灭菌双蒸水至50μl，充分混匀，反应条件为变性94℃30s，退火65℃30s，复性72℃90s，进行30个循环，再72℃延伸10min，得到串联的目的基因重组片段pp150-gB；之后以第一、二轮PCR扩增得到的pp150-gB片段、pp65片段为模板，加入引物P1和P6，扩增pp150-gB-pp65片段，反应条件同上，得到串联的目的基因重组片段pp150-gB-pp65；

③pET28a-pp150-gB-pp65重组质粒的构建与鉴定，将纯化的PCR产物pp150-gB-pp65用NdeI和XhoI酶切，并与经过同样处理的pET28a原核表达载体连接，转化到大肠杆菌TOP10中，抽取质粒DNA,进行酶切鉴定，并转化到大肠杆菌BL21中；

④pET28a-pp150-gB-pp65融合蛋白的诱导表达，将含pET28a-pp150-gB-pp65重组质粒的BL21菌液以1:100的比例加入到L.B培养液中，37℃振荡培养2小时后加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导3小时后离心收集菌体，重悬于2X样品缓冲液中,100℃煮沸，进行SDS-PAGE电泳分析；

⑤表达蛋白的纯化，取诱导后的菌体培养液离心收集菌体,经超声破碎后利用Ni蛋白纯化柱进行纯化，分别收集洗脱峰蛋白，并进行SDS-PAGE凝胶电泳分析；

⑥重组蛋白的抗原性分析，将重组的菌体蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后，切胶进行蛋白质电转移,将目的蛋白电转至PVDF膜上，用含质量浓度50g/L脱脂奶的PBS封闭PVDF膜,4℃过夜,PBS洗膜3次，以封闭液1:20稀释阳性血清，与PVDF膜于37℃共同孵育2h后，用PBS洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG，37℃孵育1h,PBS洗膜后TMB显色，至目的条带显色清晰时终止反应；

(2)胶体金结合垫的制造，以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内,用0.2MK2CO3调至pH8.0,按100ml胶体金溶液加入0.5-2mg人巨细胞病毒pp150-gB-pp65抗原，室温搅拌2小时，加入1％牛血清白蛋白BSA,1％聚乙二醇PEG20000封闭20min,12000r/m离心30分钟,弃上清，用胶体金工作液复溶至100ml,按1ml溶液铺20cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上,再置干燥间，温度20-25℃,湿度小于30％，干燥2-5小时，制成胶体金结合垫；

(3)硝酸纤维素膜的检测T线和质控C线制造，将抗IgMμ链McAb用50mmol/L Tris-HCl溶液(pH 7.8)稀释至4μg/ml，用喷膜仪在硝酸纤维素膜下部以1-1.5μl/cm的参数进行划线，包被检测T线，同时在硝酸纤维素膜上部包被pp150-gB-pp65融合蛋白IgM抗体作为质控C线，划线后将硝酸纤维素膜在干燥温度20-25℃,湿度小于30％,干燥2-5小时；

(4)试纸的装配，在干燥室内，温度20-25℃,湿度小于40％,取试纸承载板，将已包被的硝酸纤维素膜放置在试纸承载板的中部粘贴，在硝酸纤维素膜的检测T线侧搭接胶体金结合垫的1/3处粘贴，在胶体金结合垫另一侧搭接粘贴滴样垫，搭胶体金结合垫的1/5；在硝酸纤维素膜质控C线一侧搭接吸样垫,搭吸样垫的1/10；最后形成试纸。