[发明专利]一种基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体及其制备方法有效
| 申请号： | 201910052220.1 | 申请日： | 2019-01-21 |
| 公开（公告）号： | CN109666666B | 公开（公告）日： | 2021-03-05 |
| 发明（设计）人： | 罗学刚;张川;张同存;刘耀天 | 申请（专利权）人： | 天津科技大学 |
| 主分类号： | C12N9/88 | 分类号： | C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12Q1/527;C12R1/19 |
| 代理公司： | 天津盛理知识产权代理有限公司 12209 | 代理人： | 韩晓梅 |
| 地址： | 300457 天津市滨*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 分子 动力学 柔性 分析 提高 肝素 热稳定性 突变体 及其 制备 方法 | ||
1.一种热稳定性提高的肝素酶I 突变体，其特征在于：所述突变体为突变体BtHepIQ198R和/或突变体BtHepIK247W，所述突变体BtHepIQ198R的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述突变体BtHepIK247W的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
2.一种如权利要求1所述的热稳定性提高的肝素酶I 突变体的编码基因，其特征在于：所述突变体BtHepIQ198R的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述突变体BtHepIK247W的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
3.包含如权利要求书2所述的编码基因的重组质粒。
4.包含如权利要求书2所述的编码基因的转化子。
5.一种如权利要求1所述的热稳定性提高的肝素酶I 突变体的制备方法，其特征在于：步骤如下：
利用定点突变技术，向野生型肝素酶I基因BtHepI中引入突变；测序验证正确后，转化大肠杆菌Rosetta（DE3）；经诱导表达并分离纯化出热稳定性提高的突变体。
6.一种如权利要求1所述的热稳定性提高的肝素酶I 突变体的活性测定方法，其特征在于：步骤如下：
以肝素钠为底物测定肝素酶I的活性，反应体系为：1.5 mL 的离心管中加入100 μL的底物缓冲液，所述底物缓冲液为50 mmol/L 醋酸钠，5 mmol/L 醋酸钙，5 mmol/L 肝素钠的混合液，金属浴中40 ℃恒温孵育10 min，加入纯化后浓度为20-25ug/ml的酶液10 μL，反应10 min，立即加入0.06 mol/L 盐酸1 mL终止反应；在12000 r/min 条件下离心5 min，取上清液测定其在232 nm的吸光值。
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