[发明专利]一种基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体及其制备方法

说明书

本发明涉及一种基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体，所述突变体为突变体BtHepI^Q198R和/或突变体BtHepI^K247W，所述突变体BtHepI^Q198R的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述突变体BtHepI^K247W的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明突变体为热稳定性能优良的肝素酶I突变株，具有较大的工业应用潜力以及经济价值，同时热稳定性的肝素酶I对延长肝素酶I的货架周期，提高其在催化工艺中的操作稳定性和重复利用批次，降低生产成本等，具有重要的意义。

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白质表达技术领域，尤其是一种基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体及其制备方法。

背景技术

肝素酶I(GenBank:AAO79780.1)是一类能够裂解肝素类结构物质、制备低分子肝素的多糖裂解酶，来源比较广泛，主要存在于原核生物肝素黄杆菌中，还包括一些拟杆菌和芽孢杆菌等。肝素酶I首先发现于肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)，可选择性地剪切硫酸化肝素聚糖中葡萄糖胺和糖醛酸之间α(1-4)糖苷键。根据肝素酶I的各个来源的氨基酸序列以及蛋白结构特点，肝素酶I被划分为糖苷水解酶PLs的13家族。目前肝素酶I主要应用于低分子肝素的制备、体外循环中肝素的消除、肝素确切结构的解析、以及在体外诊断试剂方面用于凝血试验和血小板实验。它在制备低分子量肝素、清除体外血液循环中肝素和确定肝素精细结构方面有着重要作用。当前对于肝素酶I的研究大都来自于肝素黄杆菌，本研究研究的是来源于多形拟杆菌的肝素酶I，但基于理性设计的肝素酶I的分子改造，尤其是关于肝素酶I热稳定性的分子改造研究未见有报道。

目前市面上报道的肝素酶I的热稳定性都很差，这一大弊端，严重地限制了肝素酶I在工业上的应用。筛选出热稳定性肝素酶I的突变体，有助于优化肝素酶I降解肝素的生产工艺；此外，对于延长肝素酶I的货架周期，也具有很重要的意义。传统的定性进化方法工作量太大，无法在短时间内得到效果良好的突变体。

通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

一种提高肝素酶I活性的工程菌株构建方法(CN106497897A)，涉及一种高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表达生产方法。依照肝素酶I的空间结构分析对其氨基酸序列进行优化，获得比酶活提高48％的Hep169。然后根据密码子偏爱性优化HepI169基因，通过人工合成获得基因DNA，克隆到表达载体中与SUMO等标签进行融合表达，转化宿主细胞、筛选建立了Hep169的可溶性基因工程表达生产体系，分析结果显示目的蛋白获得了高效的可溶性表达，且具有很好的生物学活性，能高效的裂解肝素生成低分子量肝素。本发明方法不仅提供了一种高活性的HepI，而且为肝素酶I的高效可溶性基因工程表达生产提供了一种新方法，可有效降低低分子肝素等药物的生产成本，具有广泛的应用前景。

通过对比，本发明申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体及其制备方法，该为热稳定性能优良的肝素酶I突变株，与野生型相比，阳性突变体BtHepI^Q198R和BtHepI^K247W在40℃的半衰期较野生型BtHepI分别提高了30.55％和14.63％；在50℃下的半衰期较野生型BtHepI分别提高了61.04％和30.84％，具有较大的工业应用潜力以及经济价值，同时热稳定性的肝素酶I对延长肝素酶I的货架周期，提高其在催化工艺中的操作稳定性和重复利用批次，降低生产成本等，具有重要的意义。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：