[发明专利]一种基于选择性消除野生链背景干扰的基因突变检测方法

权利要求书

1.一种非疾病诊断目的的基因突变检测方法，包括以下步骤：

1）确定基因组DNA待测目标序列，该目标序列包括目标区域和非目标区域，设计并合成与野生型DNA序列目标区域互补的硫代DNA链以及与非目标区域互补的RNA封闭链，其中所述待测目标序列上可能存在突变位点的目标区域位于待测目标序列的中部，目标区域的长度控制在其熔解温度Tm在42~46°C之间；

2）对待测目标序列进行PCR扩增，利用Lambda核酸外切酶将扩增产物处理成单链；

3）将步骤2）得到的单链DNA与步骤1）合成的硫代DNA链和RNA封闭链在DNase I缓冲溶液中混合，升温退火后在50 μL体系中加入0.05U DNase I反应一段时间，热失活DNase I；

4）对步骤3）酶切产物进行测序检测。

2.如权利要求1所述的基因突变检测方法，其特征在于，步骤1）中所述待测目标序列的长度为115~130 nt。

3.如权利要求1所述的基因突变检测方法，其特征在于，目标区域的长度为 11~13 nt。

4.如权利要求1所述的基因突变检测方法，其特征在于，步骤1）中所述非目标区域位于目标区域的两端，与非目标区域互补的RNA封闭链为多条，每条长度为25~90 nt。

5.如权利要求1所述的基因突变检测方法，其特征在于，所述硫代DNA链的长度为16~59nt，包括与野生型DNA目标区域互补片段和两端的非互补片段。

6.如权利要求1所述的基因突变检测方法，其特征在于，所述硫代DNA链为全硫代DNA链。

7.如权利要求1所述的基因突变检测方法，其特征在于，步骤2）中PCR扩增采用的正向引物为5’-OH末端，反向引物的5’末端磷酸化标记，Lambda核酸外切酶选择性地消化双链DNA的5’磷酸化的链。

8.如权利要求1所述的基因突变检测方法，其特征在于，步骤2）中PCR扩增产物经Lambda核酸外切酶处理成单链后通过超滤纯化。

9.如权利要求1所述的基因突变检测方法，其特征在于，步骤3）将步骤2）得到的单链DNA与步骤1）合成的硫代DNA链和RNA封闭链在DNase I缓冲溶液中混合，升温退火后加入DNase I，在37~42°C温度下反应30~45 min，然后热失活DNase I。