[发明专利]一种基于选择性消除野生链背景干扰的基因突变检测方法

说明书

本发明公开了一种基于选择性消除野生链背景干扰的基因突变检测方法。通过PCR对待测目标序列进行扩增，并通过Lambda核酸外切酶处理成单链DNA；设计并合成与野生型DNA序列目标区域互补的硫代DNA链以及与非目标区域互补的RNA封闭链，与单链DNA混合并升温退火后加入DNase I进行切割；DNase I在硫代DNA链的引导下选择性地切除野生型DNA链目标区域序列，突变型DNA链由于目标区域内存在错配不能被DNase I切除而得以保留，从而显著提升突变型DNA链的丰度，大幅度降低了目前已有技术检测低丰度基因突变的难度。本发明方法无需复杂昂贵的仪器，容易操作，成本低，1天之内即可给出结果，可为临床肿瘤早筛和术后复发监测提供及时、可靠的基因突变信息。

技术领域

本发明涉及基因组样品处理和基因突变检测领域，特别涉及一种对基因组样品进行预处理的方法，通过该方法消除野生型DNA后，与常规测序法联用，实现超低丰度基因突变的快速、低成本测序分析。

背景技术

癌症(恶性肿瘤)是当今严重威胁人类健康的头号杀手，与癌症相关的早期诊断和术后复发监测具有重要的生物学和医学意义。基因突变是指基因组DNA分子发生了可遗传的变异现象，是导致恶性肿瘤形成的重要原因之一。传统的肿瘤基因检测手段主要是组织活检，即通过手术穿刺的方式获取肿瘤组织样本并对其进行基因检测，该方法主要针对癌变组织进行检测，对于还未形成病灶的早期肿瘤细胞无法实现有效的检测，对于已经形成病灶的肿瘤组织也可能因为肿瘤异质性而得到假阴性的检测结果。此外，这种侵入式的检测手段给患者带来较大的痛苦，且可能在手术穿刺时进一步刺激癌组织引发恶化。组织活检也不适合进行连续取样和病情跟踪检测。

随着精准医疗概念的提出和循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)¹、循环肿瘤细胞和外泌体等新型肿瘤标志物的发现，液体活检逐渐成为癌症早期诊断的新希望。ctDNA是早期肿瘤细胞脱落或者凋亡后释放至循环系统内的DNA，该DNA高度碎片化但携带肿瘤细胞的全部基因突变信息。针对循环体系内ctDNA的检测能够为肿瘤早筛和复发监测提供重要的信息。由于正常细胞在程序性凋亡的过程中也会向循环系统中释放大量的碎片化DNA，给血浆游离DNA(Cell free DNA，cfDNA)中ctDNA的检测带来很大程度的背景干扰。据文献报道，血浆中存在基因突变的ctDNA丰度一般在0.001％-10％之间，这对突变检测方法的灵敏度和选择性都提出了很高的要求。