[发明专利]一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法

说明书

本发明公开了一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法。所述方法以苯基‑3‑丁烯‑1‑酮为底物，在酮羰基还原酶、辅酶/辅酶循环氢供体NADP+/NADPH、辅酶循环酶、助溶剂和PB缓冲液的存在下，发生生物催化反应生成(S)‑1‑苯基‑3‑丁烯‑1‑醇。本发明能耗低，操作简便，反应条件温和，酶用量小，副产物少，实现了托莫西汀手性中间体的高效合成。

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，涉及一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法。

背景技术

托莫西汀(atomoxetine)是一种有效地且耐受性良好的治疗儿童、青少年和成人注意缺陷多动障碍的非兴奋性药物，目前已在包括我国在内的多个国家上市。托莫西汀有一个手性中心，R型药物疗效是S型的9倍，因而合成过程主要围绕提高手性选择性和异构混合物的拆分展开。其中，采用各种手段还原潜手性酮从而制备手性醇中间体是药物合成研究的热点。

手性化合物中间体(S)-1-苯基-3-丁烯-1-醇是合成托莫西汀的关键中间体，其合成方法主要有化学合成法(Journal of Organic Chemistry,1983,48(19):3351-3353)。目前化学方法合成路线，化学试剂锂铝氢的使用，导致成本较高，手性纯度低等问题。

与纯化学合成路线相比，酶催化反应不需要高温高压等极端催化环境，也可以减少使用对人及环境有危害的催化剂，降低了废物的产生，环境友好性好；更重要地是，酶具有优异的立体选择性，可以有效提高产率和产品的光学纯度，具有极好的产业化潜力。

文献(Tetrahedron:Asymmetry 2003,14(11):1529-1534)中采用脂肪酶合成托莫西汀中间体，合成路线如下：

该方法以1-苯基-3-丁烯-1-醇为原料，制备(S)-1-苯基-3-丁烯-1-醇，但是收率仅40％。此外该方法还存在原料价格高，收率低的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法。该方法利用重组羰基还原酶催化进行不对称还原反应制备手性醇。

实现本发明的目的的技术方案如下：

一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法，具体步骤如下：

以1-苯基-3-丁烯-1-酮为底物，在酮羰基还原酶、辅酶/辅酶循环氢供体NADP+/NADPH、辅酶循环酶、助溶剂和磷酸(PB)缓冲液的存在下，室温下生物催化反应生成(S)-1-苯基-3-丁烯-1-醇，合成路线如下：

所述的酮羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述的1-苯基-3-丁烯-1-酮与酮羰基还原酶的质量比为1:0.1～1。

所述的助溶剂选自异丙醇，甲醇或乙醇等醇溶剂。

所述的1-苯基-3-丁烯-1-酮与助溶剂的质量体积比为1:15～45，g：mL。

所述的PB缓冲液的浓度为0.1mM，pH为7.0。

所述的辅酶循环酶选自葡糖脱氢酶或异丙醇脱氢酶。

所述的辅酶循环酶与酮羰基还原酶的质量比为0.1:1。

所述的酮羰基还原酶通过酮羰基还原酶表达工程菌发酵制得，具体步骤为：将酮羰基还原酶的合成基因导入pet-28a(+)的HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点得到重组表达质粒，再将重组表达质粒转入E.coli DH5α感受态，挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体，最后将重组表达载体转入E.coli BL21中，得到酮羰基还原酶表达工程菌，发酵培养，离心收集菌体，洗涤并重悬，超声破碎，冻干得到酮羰基还原酶。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：