[发明专利]一种手足口EV71抗原检测试剂盒

权利要求书

1.一种手足口EV71抗原检测试剂盒，其特征在于，包括包被有抗EV71-VP1单克隆抗体的酶标板、HRP标记的检测用抗EV71单克隆抗体、企业参考品、样本稀释液、浓缩洗涤液、显色液A、显色液B、终止液。

2.如权利要求1所述的手足口EV71抗原检测试剂盒，其特征在于，所述抗EV71-VP1单克隆抗体在制备过程中所用抗EV71病毒抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.如权利要求1所述的手足口EV71抗原检测试剂盒，其特征在于，所述抗EV71-VP1单克隆抗体的酶标板的制备方法，包括以下步骤：

1)用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗EV71-VP1单克隆抗体，抗体的终浓度为5μg/mL，加入微孔板中，100μL/孔，2℃-8℃放置不少于16小时；

2)用pH7.2的0.01mol/L PBS洗板2次；

3)加入封闭液，120μL/孔，2℃-8℃封闭不少于16小时；

4)真空干燥3小时；

5)用铝箔袋封装包被抗体板，2℃-8℃保存。

4.如权利要求1所述的手足口EV71抗原检测试剂盒，其特征在于，所述抗EV71-VP1单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

使用EV71-VP1抗原免疫小鼠制备的抗EV71单克隆抗体，腹水过200目不锈钢筛，弃去脂肪层；量上清液体积，按体积比1:1加入pH7.2 0.01mol/L PBS，搅拌下加入饱和硫酸铵使成50％饱和度，25±2℃作用30分钟，4℃10000rpm离心15分钟，弃上清；沉淀用pH7.20.01mol/L PBS溶解，测量体积，加入饱和硫酸铵使成33％饱和度，25±2℃作用30分钟，4℃10000rpm离心15分钟，弃上清；沉淀用适量pH7.2 0.01mol/L PBS溶解，装入透析袋；用pH7.2 0.01mol/L PBS透析48小时，至无SO₄^2－为止；过Protein-A亲和层析柱，获得抗EV71单克隆抗体。

5.如权利要求4所述的手足口EV71抗原检测试剂盒，其特征在于，所述EV71-VP1抗原的制备方法，具体步骤如下：

(1)表达菌株的培养：取-70℃保存的EV71-VP1表达菌株20μL接种于LB培养基中，30℃空气摇床培养过夜，次日按5％的比例转种于LB培养基，37℃空气摇床培养约3小时，当OD600nm值达到0.7时，立即加入IPTG，并将培养瓶转到25℃摇床中，诱导培养4小时；将菌液合并，6000rpm离心20分钟，弃上清，收集沉淀部分；

(2)纯化：用pH8.3的50mmol/L Tris-HCl缓冲液悬浮沉淀，在冰浴中超声破碎菌法，每次超30秒钟，间隔30秒钟，共超10次；8℃，12000rpm，离心20分钟，取上清；过GST琼脂糖凝胶FF柱，用还原型谷胱甘肽配制的缓冲液洗脱，收集洗脱峰，各种纯化重组表位抗原均用SDS-PAGE鉴定，获得EV71-VP1抗原。

6.如权利要求5所述的手足口EV71抗原检测试剂盒，其特征在于，所述EV71-VP1表达菌株的构建，采用以下方法：

将如SEQ ID NO：1所示的VP1序列进行退火延伸PCR，为了便于基因克隆到表达载体，在连接臂的两端引入BamHI和EcoRI两个酶切位点，以适合表达载体pBET-28a；双酶切后插入载体pBET-28a中，构建相应的表达质粒；EV71-VP1抗原表达质粒，转化E.coli BL21后，通过IPTG诱导，取全菌液进行SDS-PAGE鉴定，证明该质粒均已获得了高效的表达，获得EV71-VP1表达菌株。