[发明专利]一种脂肪酶在拆分N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯中的应用

说明书

本发明提供了一种脂肪酶在拆分N‑乙酰‑DL‑甲硫氨酸甲酯中的应用，所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因如SEQ ID NO.2所示。本发明脂肪酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌工程菌；该重组大肠杆菌经细胞破碎，分离纯化获得重组脂肪酶；该重组脂肪酶具有催化拆分N‑乙酰‑DL‑甲硫氨酸甲酯的能力，可以获得N‑乙酰‑L‑蛋氨酸甲酯，对映体过量值99％和转化率达到51.2％。

(一)技术领域

本发明属于生物催化技术领域，涉及一种脂肪酶立体选择性催化水解拆分N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯对映体合成单一构型的N-乙酰-L-甲硫氨酸甲酯对映体的应用。

(二)背景技术

N-乙酰-L-甲硫氨酸(N-Ac-L-Met)是一种有价值的营养补充剂，由L-甲硫氨酸(L-Met)的化学乙酰化产生，通过酰基转移酶催化N-乙酰-DL-甲硫氨酸(N-Ac-DL-Met)的拆分制备。DL-Met是用于N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯(N-Ac-DL-MetOMe)生产的材料，通过化学合成以低成本大规模生产。已经提出了酶催化N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯的水解用于N-Ac-L-Met生产。在这个过程中，将生产N-Ac-L-Met和D-Met，它们可用作药物的非手性合成物或原料。但是，由于反应的对映体选择性差，N-Ac-L-Met的产率低，迄今为止没有开发出有效的解决方法。因此，我们提供了一种脂肪酶催化水解拆分N-Ac-DL-MetOMe来高效生产N-Ac-L-MetOMe的有效方法。酶法拆分能够利用酶的高度立体、位点、区域选择性，催化化学合成的外消旋体或衍生物中的某一对映体进行水解以获得高产率、高选择性的单一对映体，具有选择性高、反应条件温和、反应较稳定及易于工业化的特点。同时，酶法拆分可以解决化学合成易造成环境污染，产生大量无效甚至对环境有害的对映体问题，对于保护人类的自然环境和健康具有极为重要的意义。

脂肪酶(Lipase,EC 3.1.1.3)全称为三酰基甘油酰基水解酶(Triacyl-glycerolacylhydrolase)，是目前研究与工业化应用最多的一类水解酶。脂肪酶能催化酯水解、酯合成、醇解、酸解、酯酯交换和氨解反应。脂肪酶广泛存在于自然界的各种生物体，特别是在微生物和动植物组织中。动物脂肪酶主要存在于胰脏等器官组织，比如猪肝酯酶和猪胰脂肪酶，但由于动物脂肪酶活性较低、酶提取纯化成本较高和原料来源有限等因素，限制了其在工业中的应用。微生物脂肪酶来源丰富，种类繁多，不受季节气候等因素的影响，微生物生长产酶周期较短，而且具有耐有机溶剂、底物专一性强、催化选择性高和催化活性高等特点，因而微生物来源的脂肪酶有较高的工业化应用价值。目前市场上大部分商品化脂肪酶都通过细菌、真菌和酵母等微生物培养发酵获得。丹麦Novo Nordisk公司、日本Amano公司和美国Genencor公司等主要酶制造商开发了多种的商品化酶制剂。这些酶制剂公司利用分子改造技术对微生物脂肪酶进行改造，提高酶活力、稳定性和立体选择性等酶学性质，以满足不同工业领域应用的需求。因而构建脂肪酶基因工程菌从而大量生产重组脂肪酶具有十分重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种立体选择性脂肪酶在生物法拆分N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯中的应用，利用脂肪酶可以高效拆分N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯，得到高纯度N-乙酰-L-甲硫氨酸甲酯，提高产率。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种脂肪酶在拆分N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯中的应用(如图2所示)，所述脂肪酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，具体的应用方法为：以含立体选择性脂肪酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体冻干粉为催化剂，以N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯为底物，以pH 7.0缓冲液为反应介质，在25-45℃、600-800rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得N-乙酰-L-甲硫氨酸甲酯。所述催化剂用量以缓冲液体积计为10g/L，所述底物终浓度以缓冲液体积计为5-20g/L。