[发明专利]一种基于PDL1/PDL2超增强子的免疫检测点抑制剂的应用

权利要求书

1.一种PDL1/PDL2超增强子PDL1L2-SE在调控PDL1和PDL2表达中的非治疗目的应用，其特征在于，通过PDL1/PDL2超增强子的切除，抑制细胞表面PDL1、PDL2的表达，其中所述PDL1/PDL2超增强子PDL1L2-SE的DNA序列为hg19_dna range＝chr9:5498729-5502895；

包括如下过程：

PDL1/PDL2超增强子的切除过程

首先通过数据库分析，发现在PDL1与PDL2之间一段DNA序列hg19_dna range＝chr9:5498729-5502895高度乙酰化，并将该段DNA序列命名为PDL1L2-SE，于是在DNA序列：hg19_dna range＝chr9:5498729-5502895的上下游分别设计两个sgRNA：sgRNA-1、sgRNA-2，构建了两个新的Crispr/Cas9质粒；

(1-1)构建sgRNA-CRISPR质粒

(1-1-1)

1、酶切载体

2、琼脂糖凝胶电泳；

3、切胶回收；

(1-1-2)sgRNA引物退火

(1-1-3)连接

(1-2)构建稳转细胞系

(1-2-1)种板：转染前一天在六孔板里铺设SUM159细胞，细胞密度保持在30％-50％左右；

(1-2-2)转染：

1、1ug sgRNA-1和1ug sgRNA-2CRISPR/Cas9质粒同时加入50ul Opti-mem无血清转染培养基中，同样地，1ug sgVector质粒加入50ul Opti-mem无血清转染培养基中；

2、2ul Lipo2000加入50ul Opti-mem无血清转染培养基中；

3、室温放置5min后，稀释的质粒与Lipo2000混匀放置20min后均匀滴加至六孔板内；

(1-2-3)药筛：转染48h后，加入浓度为2ug/ml的puromycin，连续加药，直至所剩细胞都带有GFP⁺荧光，停药换成完全培养基继续培养细胞；

(2)PDL1/PDL2超增强子切除后的验证过程

(2-1)Genotyping：

(2-1-1)提取DNA：收集细胞，胰酶消化离心后，加入50ul buffer L和1ul Proteaseplus，55℃30min，95℃5min；

(2-1-2)PCR Amplification：

(2-1-3)琼脂糖凝胶电泳，显影观察条带位置；

(2-2)测序：将条带所在位置凝胶切下，收集在ep管中，附带上游引物，送由基因测序公司进行基因测序；

(3)PDL1/PDL2超增强子切除后，PDL1和PDL2低表达的验证过程

基因水平上，通过实时定量PCR实验：分别提取sgVector和sgPDL1L2-SE的稳转细胞的RNA，检测PDL1和PDL2的表达，发现sgPDL1L2-SE组的PDL1和PDL2的拷贝数较sgVector组明显降低；

蛋白水平上，通过Western blot实验：分别提取sgVector和sgPDL1L2-SE的稳转细胞的蛋白，检测PDL1的蛋白表达量，发现sgPDL1L2-SE组的PDL1蛋白丰度较sgVector组明显降低。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Western blot实验包括如下步骤：

收集细胞，用适当RIPA裂解液裂解细胞提取蛋白，通过BCA试剂盒测定蛋白浓度；

电泳：配置12％的SDS-PAGE凝胶，保持样品蛋白上样量相同，进行上样电泳；

转膜：在电流300mA的条件下转膜60min，使蛋白转移到PVDF膜上；

封闭：加入5％的脱脂牛奶，在摇床上封闭60min；

一抗孵育：PDL1单克隆抗体，PDL2单克隆抗体或GAPDH单克隆抗体均以1：1000的比例稀释，4℃孵育过夜；

二抗孵育：一抗回收洗涤后，根据一抗来源，选择二抗，按照1：2000的比例稀释，室温孵育2h；

显影：二抗洗涤干净后，使用ECL试剂盒，按照说明进行显影检测蛋白。