[发明专利]一种免标记荧光检测基因的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种免标记荧光检测基因的试剂盒，包括反应缓冲液、与G-quadruplex结合后荧光发生变化的荧光染料，其特征在于：还包括核酸探针LS、SS、HS和FS，其中：

核酸探针LS从5'端开始依次为I、Ⅱ和Ⅲ区域，其中I区包含链置换反应的支点序列，能通过碱基互补识别待测基因；Ⅱ区与核酸探针HS完全互补；Ⅲ区与核酸探针SS的Ⅲ^*区完全互补，使得核酸探针SS上的G-quadruplex序列被绑定；

核酸探针SS从5'端开始依次为Ⅲ^*和Ⅳ区域，其中Ⅲ^*区与核酸探针LS的Ⅲ区完全互补，Ⅲ^*和Ⅳ区共同构成G-quadruplex序列；

核酸探针FS从5'端开始依次为Ⅲ^*和Ⅱ^*区域，其中Ⅲ^*和Ⅱ^*区分别与核酸探针LS的Ⅲ和Ⅱ区完全互补；

核酸探针LS的I区的序列为：CTGGGATT；

核酸探针LD的II区的序列为：AAATAAAATAGTAAAGAGA；

核酸探针LS的III区的序列为：GCCCTACCCAATCTGTGC；

核酸探针SS的Ⅲ^*区的序列为：GCACAGATTGGGTAGGGC；核酸探针SS的Ⅳ区的序列为：GGGTTGGG；

核酸探针FS的Ⅲ^*区的序列为：GCACAGATTGGGTAGGGC；

核酸探针FS的Ⅱ^*区的序列为：TCTCTTTACTATTTTATTT；

待测基因为HIV-1；

核酸探针LS的序列为：5'-CTGGGATTAAATAAAATAGTAAAGAGAGCCCTACCCAATCTGTGC-3'；

核酸探针SS的序列为：5'-GCACAGATTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3'；

核酸探针HS的序列为：5'-TCTCTTTACTATTTTATTT-3'；

核酸探针FS的序列为：5'-GCACAGATTGGGTAGGGCTCTCTTTACTATTTTATTT-3'。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：荧光染料选自N-甲基卟啉二丙酸 IX、四(二异丙基胍基)酞氰锌、原卟啉。

4.一种非疾病诊断目的的基因检测方法，包括如下步骤：

1)提取待测样品的核酸序列，得到待测溶液；

2)将核酸探针LS、SS和HS混合并使其自然配对形成稳定的底物探针SP；

3)将待测溶液、底物探针SP和核酸探针FS混合，反应完全后加入荧光染料，测定其初始荧光值；

4)进一步反应完全后，测量反应后的荧光值；

5)根据荧光值的变化情况确定待测基因的量；

其中，核酸探针LS、SS、HS和FS如权利要求1～3任一项所述。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

将核酸探针LS、SS和HS按照1:1:1的比例混合，然后置于95 ℃的水浴锅中加热7分钟，随后缓慢冷却至室温，最终形成浓度为10 μM的稳定的底物探针SP；

将2 μL待测溶液与含有300 nM底物探针SP和300 nM核酸探针FS溶液混合，反应体系为50μL，室温下反应120分钟。