[发明专利]一种基于微膜法的超微量蛋白定量检测方法

说明书

一种基于微膜法的超微量蛋白定量检测方法，包括以下步骤：步骤一、在0.45μm孔径的水系微孔滤膜载体上进行点样，对纳克级蛋白进行标准定量，得到每个蛋白点灰度面积值后绘制标准的定量曲线；步骤二、将待测样本按照步骤一的方式，在0.45μm孔径的水系微孔滤膜载体上进行点样和定量，得到待测样本每个蛋白点灰度面积值；步骤三、将待测样本每个蛋白点灰度面积值代入步骤一的标准定量曲线进行计算，得出待测样本蛋白含量；本发明灵敏度更高，最小检测蛋白量达到50ng，待测样品体积为1μl；在50‑1000ng范围内蛋白有较好的线性关系。

技术领域

本发明涉及微量样品的蛋白定量技术领域，特别涉及一种基于微膜法的超微量蛋白定量检测方法。

背景技术

蛋白质组学是后基因组时代标志性的热点科学，在疾病诊断和药靶筛选、细胞信号转导、代谢调控网络研究等方面扮演着越来越重要的角色。同时，蛋白质组学也是一个技术依赖性的新兴学科，不断的拓展分离分析技术手段，以更高的通量、敏度和准确性得到海量的数据是蛋白质组学研究的基础。蛋白质组学主要包含定量蛋白质组学和比较蛋白质组学。比较蛋白质组学在系统生物学研究领域得到了广泛的应用，对细胞信号转导、代谢调控网络的研究中发挥着越来越重要的作用。其中，定量蛋白质组学技术是蛋白质组学研究的核心，通过高通量的检测不同样本或状态下蛋白表达量的变化，筛选到起关键作用的蛋白，从而对疾病发展机理做出更准确的解释。定量蛋白组学研究的主要技术策略有基于二维凝胶电泳的方法，稳定同位素标记结合质谱定量的方法以及非标记定量的方法等。基于2DE的定量蛋白质组学技术是通过比较不同胶上蛋白质点染色强度来寻找差异蛋白，这一过程繁琐费时，且筛选差异蛋白点的通量和可靠性都受到极大的限制；稳定同位素标记结合鸟枪法蛋白质组学是定量蛋白质组学的另一种重要手段，主要是通过不同同位素组成的试剂标记蛋白或肽段，然后进行LC/MS/MS分析，该技术降低了分析复杂度，但同时可能会丢失部分信息；基于鸟枪法蛋白质组学体系的非标定量技术可以分为两类:基于鉴定蛋白肽段数目的方法和基于质谱峰强度的方法，该方法需要的样本量很大。

准确可靠的蛋白含量测定技术是蛋白质科学的重要基础。对于组织或细胞裂解后得到的蛋白提取液，一般采用Lowry法，Bradford法或BCA法对蛋白量进行测定。这些方法利用标准蛋白(牛血清白蛋白最为常见)制作标准曲线，然后测定样品的蛋白浓度。Lowry法的灵敏度可达5-100μg/ml，对不同蛋白的差别较小，但干扰物质较多(如巯基化合物或糖类等还原性物质)，反应较慢，有时会出现标准曲线非线性等问题。Bradford法的灵敏度是Lowry法的4-5倍，灵敏度为1-100μg/ml。反应重复性好，线性关系好，精确度高。缺点在于不同蛋白与染料结合量不同，测定与标准蛋白质组成有较大差异的样品时，有一定误差。BCA标准检测方法的灵敏度为0.5-1200μg/ml。上述方法都是比较常用的蛋白定量方法，但是对微量蛋白样本(纳克级蛋白样品)却没办法准确定量。因此，发明一种对纳克级蛋白样品的定量快速有效的方法具有十分重要的意义。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种基于微膜法的超微量蛋白定量检测方法，采用与待测样品组成类似、简单易得的复杂体系蛋白(如组织提取液与细胞提取的蛋白组成类似、血浆蛋白与脑脊液等体液的组成类似)，利用BCA法测定其蛋白浓度；然后以该复杂体系作为标准，利用0.45μm水系滤膜作为载体制作标准曲线，进而实现对待测样本微量蛋白的定量；和原有的蛋白定量方法相比，灵敏度更高，最小检测蛋白量达到50ng，待测样品体积为1μl；在50-1000ng范围内蛋白有较好的线性关系。

为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种基于微膜法的超微量蛋白定量检测方法，包括以下步骤：

步骤一、在0.45μm孔径的水系微孔滤膜载体上进行点样，对纳克级蛋白进行标准定量，得到每个蛋白点灰度面积值后绘制标准的定量曲线；