[发明专利]非洲猪流感病毒DNA连接酶的晶体及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体为一种非洲猪流感病毒DNA连接酶的晶体及其制备方法和应用。本发明DNA连接酶AsfvLIG含419个氨基酸，分子量约为45kDa；在表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)中具有高度可溶性表达。通过X射线衍射的方法获得了其三维结构，分辨率达到2.5Å。一个晶体学不对称单位中有一个蛋白分子，由9个α螺旋以及17个β折叠组成；同时结合其催化反应底物DNA。该结构中第153位天冬酰胺、第211位亮氨酸、第402亮氨酸和第403谷氨酰胺具有与人源DNA连接酶不同的构象。该DNA连接酶AsfvLIG的晶体结构可在针对非洲猪瘟病毒药物设计或药物筛选中具有广泛的用途。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及来源于非洲猪流感病毒Asfivirus属中DNA连接酶AsfvLIG表达纯化、晶体生长方法、晶体结构及其应用。

背景技术

非洲猪流感病毒（African swine fever virus, ASFV）是一种双链DNA病毒，归属于Asfivirus属，并且是目前仅知的Asfarviridae家族病毒。ASFV病毒的传染性非常强，既能感染野生猪，也能感染家猪。ASFV病毒的潜伏期非常短，有些情况下两天左右便会出现病症。非洲猪流感的早期症状包括发热、厌食、四肢泛力等，这些同正常的猪流感的症状很相似，因此早期非洲猪流感常被误诊为正常的猪流感。后期的时候，感染ASFV的猪会出现体温下降、皮肤发红等与正常猪流感不同的症状，但此时猪的淋巴结、肾脏、胃肠粘膜等部位已明显出血，并会迅速死亡。

中国、美国以及联合国卫生部们在内的多个国家和组织开展了很多合作研究。但是，目前还没有任何有效的ASFV病毒检测手段和疫苗被研发出来，大规模屠宰和焚烧受感染的猪仍是控制ASFV病毒漫延的最主要手段。ASFV病毒是已报道的最复杂的DNA病毒之一，其基因组全长在170-190kb之间，编码了150-170种不同的蛋白。这些蛋白参与了ASFV病毒生命循环的多个过程，包括基因表达、DNA复制、病毒颗粒组装、宿主细胞侵染以及宿主免疫应答的抑制等。同正常的猪流感病毒相比，ASFV病毒基因组的突变频率要高很多。仅通过对其中一个基因B6464L的3’-端序列测定，就有20多个不同的ASFV基因型被鉴定出来。这些不同基因型的形成使得ASFV疾病的症状、诊断和预防都变得更加困难。

ASFV病毒可以在猪的多种不同细胞中复制，其中单核巨噬细胞是ASFV病毒最主要的宿主细胞。虽然ASFV病毒的DNA合成起始于细胞核，但其主要的DNA合成以及病毒颗粒组装的过程则是在细胞质中完成的。巨噬细胞的细胞质为富氧环境，其中氧自由基的含量很高。这些高浓度氧自由基的存在对ASFV病毒的基因组造成了持续不断的损伤，导致了ASFVDNA链的断裂以及碱基脱嘌呤环等。为了有效地对抗这类DNA损伤，ASFV基因组编码了三个DNA修复蛋白（包括DNA剪切酶AsfvAP, DNA合成酶AsfvPolX以及DNA连接酶AsfvLIG），构成了一条完整的Base excision repair (BER) 修复通路。其中AsfvAP负责将脱嘌呤的碱基（dF）从DNA链上剪切掉，形成缺口；AsfvPolX则负责将缺失的DNA补充完整；在ATP的参与下，AsfvLIG将DNA骨架上的缺口连接起来，完成修复过程。