[发明专利]一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法

权利要求书

1.一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、取百子莲的叶片冲洗消毒，去除外部2～3片包裹的老叶，并切掉上下两端的组织，得叶片基部组织；

B、将叶片基部组织切块后接种于愈伤组织诱导培养基中进行培养；

C、将经步骤B培养后获得的带有残留叶片组织的愈伤组织块放置在愈伤组织继代培养基上进行继代培养；

D、将经步骤C培养后获得的愈伤组织块放置在胚性愈伤组织诱导培养基上进行培养，得含胚性细胞的愈伤组织块；

步骤B中，所述愈伤组织诱导培养基的组分包括：4.43 g∙L^-1 MS固体培养基、 1.5～2.0mg∙L^-1 PIC、 2.5～3.5%（w/v）蔗糖、0.8～1.0%（w/v）琼脂，所述培养基的pH为5.8；

步骤C中，所述愈伤组织继代培养基的组分包括：4.43 g∙L^-1 MS固体培养基、1.0～1.5mg∙L^-1 PIC、2%（w/v）蔗糖、1%（w/v）麦芽糖、0.8～1%（w/v）琼脂，pH5.8；

步骤D中，所述胚性愈伤组织诱导培养基的组分包括：4.43 g∙L^-1 MS固体培养基、1.0～1.5 mg∙L^-1 PIC 、 2%（w/v）葡萄糖、2%（w/v）麦芽糖、0.8～1%（w/v）琼脂，pH5.8；

步骤B、C、D中，采用的培养条件为暗培养，所述MS固体培养基为MS固体培养基干粉。

2.根据权利要求1所述的以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，其特征在于，步骤A中，所述百子莲的叶片为离根茎连接部位0～2.0 cm处的叶片；所述百子莲为2～3年生百子莲。

3.根据权利要求1所述的以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，其特征在于，步骤A中，所述冲洗消毒的具体步骤如下：将百子莲的叶片流水冲洗90～150 min后置于超净工作台，75%（v/v）乙醇处理50～70 s，用ddH₂O冲洗3～5次，然后用5%次氯酸钠消毒处理5～7 min，之后ddH₂O冲洗3～5次，再用75%乙醇处理50～70 s，用ddH₂O冲洗3～5次。

4.根据权利要求1所述的以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，其特征在于，步骤B中，所述叶片基部组织切块后的尺寸为0.5～0.8 cm；所述培养条件为：温度22～28℃，暗培养 25～35天。

5.根据权利要求1所述的以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基的制备方法包括以下步骤：

每升ddH₂O中加入4.43 g MS固体培养基干粉，溶解后加入PIC溶液、蔗糖、琼脂，调节pH值为5.8；获得的培养基灭菌处理后分装，冷却凝固。

6.根据权利要求1所述的以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，其特征在于，步骤C中，所述继代培养条件为：温度22～28℃，培养周期为55～65 d，继代培养2次。

7.根据权利要求1所述的以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，其特征在于，步骤D中，所述培养条件为：温度22～28℃，暗培养 55～65 d。