[发明专利]一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法

说明书

本发明提供了一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，包括：A、取百子莲的叶基部冲洗消毒，去除外部包裹的老叶，并切掉上下两端的组织，得叶片基部组织；B、将叶片基部组织切块后接种于愈伤组织诱导培养基中进行培养；C、将经步骤B培养后获得的愈伤组织块放置在愈伤组织继代培养基上进行继代培养；D、将经步骤C培养后获得的愈伤组织块放置在胚性愈伤组织诱导培养基上进行培养，得含胚性细胞的愈伤组织块。本发明在叶基部组织诱导愈伤组织上成功进行胚性细胞的诱导，愈伤组织诱导率达到了92.60％，胚性细胞诱导率达到76.36％，诱导周期仅为6～7个月。且该胚性细胞诱导成苗较快，避免了长期继代过程，减少了畸形苗发生。

技术领域

本发明涉及一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法。

背景技术

百子莲‘Big Blue’(Agapanthus praecox ssp.orientalis‘Big Blue’)又名“蓝百合”、“非洲百合”，原产非洲南部，为单子叶多年生草本花卉，具有较强的观赏性。近半个世纪以来，百子莲在国际花卉业发展中脱颖而出，成为风靡全球的鲜切花、盆栽及地被花卉，并体现出极佳的观赏价值。此外，百子莲抗性极强，在道路绿化、土壤修复领域具有巨大的发展空间，目前市场上种苗供不应求。

百子莲在原产地南非常用种子或分株繁殖，但引种国内后存在发芽率低，繁殖周期长，繁殖系数低及后代易分化等缺点。组织培养是保持百子莲优良性状、获得大量种苗的重要途径。目前百子莲的组织培养分为器官发生途径和体细胞胚胎发生途径两大类。其中器官途径已经应用于产业化生产，但也存在诸多问题，例如繁殖系数较低，成苗周期长等。而体细胞胚胎发生途径具有数量多、繁殖快、结构完整、植株再生率高以及不受季节影响等特点，因此被认为是百子莲无性扩繁和种质保存的较佳途径。

因为小花梗无菌处理比较容易，诱导愈伤组织相对快捷，国内以百子莲进行体胚诱导的外植体多选择小花梗，但小花梗的取材有较大局限性，每年仅5～6月份百子莲蕾期方可取材，而且胚性细胞的诱导周期较长，达9个月之久。而百子莲的叶片可取材料多，取材方便，不受发育周期及季节限制，四季均可培养。因此，相对于小花梗，利用叶片诱导出愈伤组织，进而诱导出胚性细胞具有较大的应用价值，以叶片作为外植体的体胚发生途径对百子莲快繁是较佳途径。

国内的一些研究表明，通过叶片作为外植体，以2,4-D作为主要生长调节剂并未获得愈伤组织。在组织培养研究中，单子叶植物通常比双子叶植物更难形成愈伤组织，而PIC可以作为外源生长素类物质降低单子叶植物组织培养的难度。碳源是植物组织培养过程中的最重要因素之一，糖作为碳源，不仅为细胞提供合成新化合物的碳骨架，而且为细胞的生理代谢提供底物与能量。植物组织培养一般采用蔗糖、葡萄、麦芽糖、果糖等作为碳源，不同种类及浓度的碳源对愈伤组织的诱导效果也不相同。而百子莲以往的研究中，仅仅以蔗糖作为碳源，其他种类碳源对百子莲组培、体胚诱导的效果并未见报道。

本发明根据前期研究基础，试图改变前期依赖小花梗取材的局限性，利用叶片作为外植体进行愈伤组织的诱导。同时，本发明通过调控激素及碳源的种类和水平，拟解决百子莲胚性细胞诱导周期长、诱导率较低的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法。本发明根据单子叶植物再生潜能细胞的分布特点，利用叶片基部分生区组织作为外植体进行愈伤组织的诱导，突破国内目前愈伤组织只能利用小花梗进行诱导的局限性；本发明利用单子叶植物特异性生长素类物质PIC作为主要诱导激素，克服了单子叶植物叶片愈伤组织诱导困难的问题；根据植物体胚发生过程中碳源调控的规律以及单子叶植物体胚发生的特点，本发明利用蔗糖、葡萄糖以及麦芽糖作为碳源，通过种类和浓度配比的切换，改变了传统组织培养和体胚途径仅以蔗糖作为碳源的方法，提高了愈伤组织、胚性愈伤组织的诱导率，缩短了胚性细胞的诱导周期。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，包括以下步骤：