[发明专利]一种葡聚糖硫酸钠联合脂多糖诱导的小鼠原代结肠粘膜上皮细胞炎症模型的建立方法

说明书

本发明公开一种葡聚糖硫酸钠联合脂多糖诱导的小鼠原代结肠粘膜上皮细胞炎症模型的建立方法，属于细胞炎性模型技术领域。本发明首次使用葡聚糖硫酸钠联合脂多糖作为刺激物诱导处理小鼠原代结肠粘膜上皮细胞建立细胞炎症模型，且首次使用结肠粘膜上皮细胞作为DSS联合LPS诱导炎症模型的造模细胞，通过测定细胞抑制率和细胞上清液TNF‑α，IL‑1β水平确定了葡聚糖硫酸钠和脂多糖溶液的最佳使用浓度和细胞孵育时间，操作容易、成本较低，可帮助初次进行小鼠原代结肠粘膜上皮细胞培养和细胞炎症激模型的研究人员比较顺利的完成小鼠原代结肠粘膜上皮细胞的培养和细胞炎症模型的建立。

技术领域

本发明属于细胞炎性模型技术领域，更具体地，涉及一种葡聚糖硫酸钠联合脂多糖诱导的小鼠原代结肠粘膜上皮细胞炎症模型的建立方法。

背景技术

目前认为肠上皮细胞是粘膜表面调节自然和获得性免疫系统的重要角色，面对细菌的侵入，结肠上皮细胞上调一系列前炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8及化学趋化因子及前列腺素的表达和产生。肠上皮细胞提供的早期信号，对细菌侵袭宿主的炎性反应初期调节非常重要，从这种角度看，上皮细胞可被认为是粘膜表面对细菌入侵的最早的传感器，是粘膜的看护者。

葡聚糖硫酸钠(DSS)携带硫酸盐基团的高负电荷，对结肠上皮有毒性作用，并诱导侵蚀，最终损害屏障，致使结肠上皮通透性增加，其抗凝血特征加剧肠出血，并发血便，同时也引发肠道内细菌感染肠炎，为最经典的溃疡性结肠炎诱导物。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，脂多糖对宿主是有毒性的。脂多糖只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以也叫做内毒素。其毒性成分主要为类脂质A。内毒素位于细胞壁的最外层、覆盖于细胞壁的粘肽上。各种细菌的内毒素的毒性作用大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。

TNF-α是肿瘤坏死因子，它可以促进T细胞产生各种炎症因子，提高中性粒细胞的吞噬能力，增加过氧化物阴离子产生，增强ADCC功能，刺激细胞脱颗粒和分泌髓过氧化物酶，与内皮细胞培养可使其增加MHCⅠ类抗原、ICAM-1的表达，IL-1、GM-CSF和IL-8的分泌，并促进中性粒细胞粘附到内皮细胞上，从而刺激机体局部炎症反应。TNF-α与相应受体结合后向细胞内移，被靶细胞溶酶体摄取导致溶酶体稳定性降低，各种酶外泄，引起细胞溶解。TNF-α激活磷脂酶A2，释放超氧化物而引起DNA断裂，磷脂酶A2抑制剂可降低TNF的抗病效应，或可改变靶细胞糖代谢，使细胞内pH降低，导致细胞死亡。

IL-1β(白介素1β)通过调控白细胞和内皮细胞的整合素的表达，启动和控制炎症反应，并且与配体结合，形成IL-1RI，随后招募辅助受体链，称为辅助蛋白(IL-1RAcP)。由IL-1RI加IL-1β加辅助受体形成复合物。通过将衔接蛋白MyD88募集至Toll-IL-1受体(TIR)结构域来启动信号。几种激酶被磷酸化，NF-κB易位至细胞核，并且发生了大量炎症基因的表达，释放到细胞外空间中存在强烈的中性粒细胞浸润。

目前，还没有关于体外建立与葡聚糖硫酸钠相关的结肠粘膜上皮细胞的炎症模型的相关内容，那么，建立一种葡聚糖硫酸钠联合脂多糖诱导的小鼠原代结肠粘膜上皮细胞炎症模型是具有重要意义的。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种葡聚糖硫酸钠联合脂多糖诱导的小鼠原代结肠粘膜上皮细胞炎症模型的建立方法。该方法操作容易、成本较低。

本发明的另一目的在于提供通过上述方法建立得到的葡聚糖硫酸钠联合脂多糖诱导的小鼠原代结肠粘膜上皮细胞炎症模型。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种葡聚糖硫酸钠联合脂多糖诱导的小鼠原代结肠粘膜上皮细胞炎症模型的建立方法，包括如下步骤：