[发明专利]一种小鼠肠上皮隐窝细胞系及其构建与培养方法

权利要求书

1.一种小鼠肠上皮隐窝细胞系的构建方法，其特征在于，所述构建方法的具体步骤为：

（1）肠上皮隐窝细胞的分离：取小鼠空肠中下部和回肠中上部，洗净，将肠管组织剪碎，移至分离缓冲液I中，翻转摇动，吸出缓冲液I，加入缓冲液II，剧烈震荡，过滤，去除肠管及非隐窝上皮，滤液离心收集隐窝细胞，隐窝细胞采用胰酶消化得到单细胞悬液，终止消化，离心收集；所述缓冲液I为EDTA的磷酸缓冲盐溶液，所述缓冲液II是D-山梨醇和蔗糖的磷酸缓冲盐溶液；

（2）肠上皮隐窝细胞系的构建：将步骤（1）最终收集的隐窝细胞用ENR 培养基重悬，接种，转染含有SV40TAg表达元件和piggyBac转座酶剪切位点的质粒载体，24小时内，用表达piggyBac 转座酶的腺病毒感染，更换新的ENR 培养基，进行经药物筛选、连续传代后得到肠上皮隐窝细胞系；所得到的肠上皮隐窝细胞系具有肠上皮祖/干细胞特性，单个细胞在三维培养条件下可以形成特征性的类器官。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述缓冲液I中EDTA的浓度为0.5-4mmol/L，所述缓冲液II中D-山梨醇的浓度为40-70mmol/L，蔗糖的浓度为30-60mmol/L。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述缓冲液I中EDTA的浓度为2mmol/L，所述缓冲液II中D-山梨醇的浓度为54.9 mmol/L，蔗糖的浓度为43.4 mmol/L。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述ENR培养基是以Advanced DMEM/F12为基础的无血清培养基，其中含有表皮生长因子EGF、Noggin蛋白和R-Spondin2。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述ENR培养基中，表皮生长因子EGF 的浓度为30-80ng/mL，Noggin蛋白的浓度为80-120ng/mL，R-Spondin2的条件培养基与Advanced DMEM/F12培养基的体积比为08-1.2:8-12。

6.权利要求1-5所述任一构建方法构建的肠上皮隐窝细胞系，其特征在于，所得到的肠上皮隐窝细胞系具有肠上皮祖/干细胞特性，单个细胞在三维培养条件下可以形成特征性的类器官。

7.权利要求6所述肠上皮隐窝细胞系的培养方法，其特征在于，将所述肠上皮隐窝细胞系采用胰酶消化，传代，采用ENR培养基培养，每2-3天传代一次。