[发明专利]一种小鼠肠上皮隐窝细胞系及其构建与培养方法

说明书

本发明属于分子与细胞生物技术领域，具体涉及一种小鼠小肠上皮隐窝细胞系的构建方法，该方法通过通过特殊分离方法制成隐窝上皮细胞单细胞悬液，贴壁后采用进行永生化。这一细胞系良好地保持了肠上皮原代细胞的形态，具有旺盛的增殖能力。其在三维培养条件下可以形成特征性的类器官结构，特异性染色表明组成这一结构的细胞包括多种肠上皮分化子代。建系后的隐窝细胞仍然只能在原代培养条件下才能生长，其可应用于建立小鼠小肠上皮体外多维研究模型，用于研究肠道生理功能以及包括感染、癌症发生等在内的病理机制，同时为包括肠癌在内的肠道疾病的治疗靶点和药物筛选与评价提供了工具和平台。

技术领域

本发明属于分子与细胞生物技术领域，具体涉及一种小鼠肠上皮隐窝细胞系、其构建与培养方法。

背景技术

肠道上皮细胞是体内更新速度最快的细胞类型之一，隐窝细胞则为这种更新提供源源不断的细胞供应，沿基膜离开隐窝的细胞逐渐分化为不同类型的成熟上皮细胞，如吸收上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞和M细胞等，这些子代细胞发挥着不同的功能共同维持了肠上皮系统的生理功能。肠上皮系统是一个精致的研究干细胞生物学和细胞谱系发生模型，也是研究哺乳动物组织更新、多功能干细胞、二元谱系决定以及细胞程序化死亡最简单的研究模型。因此，研究过程中，需要大量的肠上皮隐窝细胞系作为研究工具。

大部分商品化或者研究用的原代细胞都存在传代次数有限的问题，不同代次的细胞，特性差异巨大，使得基于其的研究结果重复性差。为解决这一问题，则需实现对某类细胞的永生化，构建对应永生化细胞系。

发明内容

为解决上述问题，发明人尝试构建隐窝细胞的永生化细胞系，首先尝试了隐窝细胞的体外培养，由于肠上皮结构中包含上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞和M细胞等多种子代细胞，且隐窝细胞位于隐窝底部，采用传统分离方法分离时常常难以得到完整的、无污染的、数目可观的隐窝结构。即便通过大量的分离工作得到一定量的隐窝细胞，采用传统培养基进行体外培养时，原代细胞不能贴壁生长，生长缓慢或不能生长。

通过发明人的对隐窝结构的长期研究，选用了两种不含酶的缓冲液对隐窝细胞进行分离，避免了间质细胞和其他子代细胞的污染，得到了大量无污染的隐窝结构，当采用传统培养基培养无污染的隐窝细胞时，其生长缓慢或者不能生长。进而发明人对培养基进行了研究，最终配制了以EGF(↑) WNT(↑)BMP(↓)分子信号组合为主要特征的无血清培养基（ENR培养基），培养原代隐窝细胞，在该培养基中，原代上皮隐窝细胞能够贴壁生长，生长速度快，且能保持隐窝细胞表型。

在完成隐窝细胞的体外培养后，发明人尝试了对原代细胞的永生化，在尝试了多个永生化系统后，选用了CN105002217A中的永生化系统对隐窝细胞进行转染，获得永生化隐窝细胞，然后采用了上述无血清培养基对永生化隐窝细胞进行传代培养，传代次数高达20次后，仍能保持隐窝细胞的原始特性，同时，在建系后的细胞中同样保持对上述信号组合的“依赖”，并保持了隐窝细胞多向分化的潜能，实现了对隐窝细胞的条件永生化。

以下为本发明的技术方案：

一种小鼠肠上皮隐窝细胞系（iMICs）的构建方法，依次采用缓冲液I和缓冲液II分离除去非隐窝上皮得到隐窝细胞；然后将隐窝细胞用含有SV40TAg表达元件和piggyBac转座酶剪切位点的质粒载体转染，再用表达piggyBac 转座酶的腺病毒或质粒载体感染得到永生化隐窝细胞；采用ENR培养基培养永生化隐窝细胞，筛选，传代得到肠上皮隐窝细胞系；所述缓冲液I为EDTA的磷酸缓冲盐溶液，所述缓冲液II是D-山梨醇和蔗糖的磷酸缓冲盐溶液。

优选的，所述缓冲液I中EDTA的浓度为0.5-4 mmol/L，所述缓冲液II中D-山梨醇的浓度为40-70 mmol/L，蔗糖的浓度为30-60 mmol/L，更为优选的，所述缓冲液I中EDTA的浓度为2mmol/L，所述缓冲液II中D-山梨醇的浓度为54.9 m mmol/L，蔗糖的浓度为43.4mmol/L。