[发明专利]化学试剂增加水稻等位基因替换编辑效率

说明书

本申请涉及基因编辑领域，特别地涉及水稻基因编辑中的等位基因替换。本申请使用化学试剂来增加水稻等位基因替换编辑效率。特别地，本申请涉及使用化学试剂例如化合物SCR7或RS‑1来增加在水稻基因编辑中的等位基因替换效率的用途和方法。

技术领域

本申请涉及基因编辑领域，特别地涉及水稻基因编辑中的等位基因替换。本申请提高了水稻中等位基因替换编辑的效率。

背景技术

基因编辑技术，特别是以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术，是遗传研究领域革命性的技术。它在植物基因功能研究和作物遗传育种方面发挥了重大的作用。基因编辑主要是通过不同的序列特异核酸酶(ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1)在基因组特定位置产生双链断裂，进而通过自身的非同源末端连接或者是同源重组机制，实现对基因组的修饰，包括缺失、插入和替换等。

基因替换编辑技术是基因编辑技术中的一种，它是通过核酸酶介导对目标基因进行替换的编辑技术，特别是基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑技术，可以在基因组靶向位点处产生DNA双链断裂(DSB)，以人为提供的外源供体DNA为模板，通过同源重组(HR)介导的DNA修复途径来实现对目标基因的替换。与插入缺失的突变相比，基因替换编辑技术在农作物遗传改良与基因功能鉴定中具有更重要的作用和实际应用价值。

同源重组修复是一种精确的修复方式，对于维持基因组的完整性和稳定性至关重要。但是在真核生物中，非同源末端连接修复效率远远大于同源重组的修复效率，所以真核生物中基因替换具有很大的挑战性，也是基因编辑领域研究的一个热点。同源重组修复主要发生在细胞的G2期和S期^[1]，在整个G1期几乎没有同源重组修复。Gutschner等人利用蛋白质工程方法，直接同步Cas9的表达与细胞周期，控制基因组的时空编辑，来增加同源重组的效率^[2]。Yang等人也证实将细胞同步在G2/M期后基因敲入的效率会增加3到6倍^[3]。

Cpf1作为新一代的基因编辑工具，有很多与CRISPR/Cas9不同的优势，其中Cpf1剪切之后产生的是粘性末端，这有会更有利于基因的定点插入。Begemann等人曾在水稻中用Cpf1做基因定点插入，效率达到了8％，这是其他的核酸酶都没法达到的效率^[4]。

基因替换编辑技术中关键的一步是产生双链断裂的同时能将DNA模板递送到位，Butt等人应用CRISPR/Cas9系统，将模板串联在gRNA的后面，这样在产生双链断裂的同时，模板可以及时地用来修复，从而提高基因替换的效率^[5]。

双生病毒科病毒是一类具有环状单链DNA(circular single strand DNA)基因组的植物病毒，寄主范围广泛，包括单子叶和双子叶植物。基因组大小为2.5-3.0kb，病毒感染寄主细胞后会通过滚环复制产生大量的DNA复制子，可作为同源重组修复的模板。Baltes等人最早将双生病毒复制子用于提高植物基因替换编辑的效率，与传统的农杆菌转化相比，菜豆黄矮病毒(Bean yellow dwarf virus，BeYDV)的复制子可以将基因替换的效率提高一到两个数量级^[6]。随后他们实验室又将这一技术应用到西红柿上，创造了可遗传的基因敲入后代，与传统的DNA导入方法相比，基因敲入的效率提高了10倍^[7]。同样地，菜豆黄矮病毒复制子也被应用于马铃薯，用来提高基因替换的效率^[8]。Gil-Humanes等人在小麦中利用小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus，WDV)用于DNA模板复制，将基因敲入的效率大大提高，在报告系统中效率提高了110倍，在一个内源基因位点效率也提高到原来的12倍^[9]。Wang等人将小麦矮缩病毒的系统引入到水稻上用于基因替换编辑，使基因替换编辑的效率达到了19.4％^[10]。