[发明专利]一种体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法在审
| 申请号： | 201910066688.6 | 申请日： | 2019-01-24 |
| 公开（公告）号： | CN109810944A | 公开（公告）日： | 2019-05-28 |
| 发明（设计）人： | 赵报;邓蒙蒙;刘丹;吴疆;王保如;程箫 | 申请（专利权）人： | 安徽瑞达健康产业有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/0783 | 分类号： | C12N5/0783;A61K35/17;A61P35/00 |
| 代理公司： | 合肥方舟知识产权代理事务所(普通合伙) 34158 | 代理人： | 刘跃 |
| 地址： | 230088 安徽省合肥市高新区*** | 国省代码： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 细胞毒活性 扩增 种体 增高 无血清培养基 单个核细胞 免疫分选 免疫治疗 细胞因子 肿瘤细胞 高纯度 换液 可用 去除 体外 收获 | ||
1.一种体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，包括以下步骤：
(1)分离单个核细胞；
(2)免疫去除CD3+T淋巴细胞，去除CD3+T淋巴细胞后的单个核细胞的接种浓度为0.1-2×106cells/ml；
(3)加入无血清培养基和扩增因子；
(4)培养第2-5天全换液；
(5)NK细胞收获；
其特征在于：步骤3中加入的扩增因子为：IL-15、IL-12、IL-21、IL-18、IL-2。
2.根据权利要求1所述体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，其特征在于：步骤3中加入的扩增因子终浓度为10-500ng/ml IL-15、10-500ng/ml IL-12、10-500ng/ml IL-21、10-500ng/ml IL-18和500-2000U/ml IL-2。
3.根据权利要求1所述体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，其特征在于：免疫去除CD3+T淋巴细胞的方法为免疫磁珠分选、膜泡分选和流式细胞仪分选等；去除CD3+T淋巴细胞后的单个核细胞的接种浓度为0.1-2×106cells/ml。
4.根据权利要求1所述体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，其特征在于所述IL-15浓度为120-350ng/ml，IL-12浓度为100-300ng/ml。
5.根据权利要求1所述体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，其特征在于所述IL-21浓度为100-380ng/ml。
6.根据权利要求1所述体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，其特征在于所述IL-18浓度为100-300ng/ml。
7.根据权利要求1所述体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，其特征在于所述IL-2浓度为1000-1800U/ml。
8.根据权利要求1所述体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，其特征在于所述单个核细胞来源于外周血、脐带血、骨髓或诱导性多能干细胞。
9.根据权利要求1所述体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，其特征在于：优选第4天全换液培养，细胞浓度优选为1×106cells/ml；第4天后根据细胞生长状态补加含扩增所需细胞因子的无血清培养基调整细胞浓度为1×106cells/ml。
10.一种体外扩增NK细胞的应用，其特征在于：采用权利要求1-9任一所述制备的NK细胞用于肿瘤细胞免疫治疗。
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