[发明专利]一种体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法

说明书

本发明公开一种体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，体外稳定扩增NK细胞方法包括以下步骤：(1)分离单个核细胞；(2)免疫分选去除CD3⁺T淋巴细胞；(3)加入含NK细胞扩增所需细胞因子(终浓度为10‑500ng/ml IL‑15、10‑500ng/ml IL‑12、10‑500ng/ml IL‑21、10‑500ng/ml IL‑18和500‑2000U/ml IL‑2)的无血清培养基；(4)第2‑5天NK细胞全换液；(5)NK细胞收获。该方法可以稳定获得大量高纯度、高细胞毒活性NK细胞，可用于肿瘤细胞免疫治疗。

技术领域：

本发明涉及到免疫细胞治疗领域，具体是一种自体或同种异体外周血单个核细胞在体外稳定的、大量扩增高纯度、高细胞毒活性的NK细胞的方法。

背景技术：

细胞免疫治疗是目前最具有前景的肿瘤治疗方式之一，通过体外扩增或改造后回输到病人体内达到杀伤肿瘤细胞的目的或者通过活化机体免疫系统，增强肿瘤患者自身免疫功能从而抵抗肿瘤。目前，NK细胞免疫治疗受到越来越多的重视。NK细胞占人外周血淋巴细胞的5-15％，一般定义其表型为CD3^-CD56⁺，NK细胞又可以进一步细分为两个主要的亚群：具有免疫调节功能的CD56^highCD16^-细胞和具有细胞毒活性的CD56^dimCD16⁺细胞。NK细胞在抗病毒感染和抗肿瘤的早期免疫反应中发挥着重要的免疫监视功能，NK细胞不需要识别肿瘤特异性抗原，便可直接、快速的发挥细胞毒活性。特别重要的是NK细胞能够有效地清除机体内的肿瘤干细胞样细胞，抑制肿瘤的生长和转移。最新的研究表明，阻断NK细胞表面的免疫检测点受体TIGIT，可以有效的阻止NK细胞的耗竭，促进NK细胞依赖的肿瘤免疫，抑制多种小鼠恶性肿瘤的生长。阻断PD-1/PD-L1信号通路可以激活NK细胞和T细胞、逆转肿瘤免疫微环境，增强机体内源性抗肿瘤免疫效应。因此，NK细胞在机体免疫系统抵抗肿瘤的反应中发挥必不可少的作用，机体NK细胞功能紊乱，是肿瘤发生、发展的可能原因之一。自体或者同种异体NK细胞已经用于治疗恶性淋巴瘤、难治性非霍奇金淋巴瘤、复发性/难治性急性白血病、急性髓性白血病、儿童复发/难治性神经母细胞瘤、晚期胃癌、结直肠癌、结直肠癌/胰腺癌肝转移以及多种复发性、转移性实体瘤。临床显示出良好的耐受性和一定的治疗效果。NK细胞的治疗效果和回输的NK细胞的纯度和数量呈正相关。目前已经有一些可提供临床使用的NK细胞扩增技术，但是多采用饲养细胞(例如，表达IL-15和41BB配体的K562细胞、EBV转化的类淋巴母细胞细胞系、Wilm’s肿瘤细胞、射线辐照的PBMCs等)进行刺激外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)或者纯化富集后的NK细胞获得大量功能完备的NK细胞。现有的NK细胞扩增方法要么NK细胞的扩增数量较低，难以满足临床应用需求；要么采用饲养细胞的培养方法，临床应用存在一定的风险，而且NK细胞扩增培养步骤繁琐，成本较高，NK细胞比例相对较低，有残留的T细胞和B细胞，具有引起GVHD的风险。目前一些专利文献报道的无饲养细胞的NK细胞扩增方法，多采用anti-CD3抗体和anti-CD16抗体包被细胞培养瓶刺激、活化NK细胞，细胞培养方法繁琐、不稳定、扩增的NK细胞纯度较低。因此，急需开发一种稳定的、无血清、无饲养细胞的NK细胞扩增培养体系。

发明内容：

为解决现有技术存在的不足，解决现有NK细胞培养技术繁琐、NK细胞纯度低、杀伤功能弱、培养体系不稳定的缺点，本发明提供一种无血清、无饲养细胞的NK细胞体外扩增方法，可在体外培养条件下稳定的、大量扩增高纯度、高细胞毒活性的NK细胞，从而能够有效的提供满足临床应用所需的NK细胞。

为了达到上述目的，本发明设计了一种无血清、无饲养细胞的NK细胞体外扩增方法，扩增方法由以下步骤构成：

(1)分离单个核细胞；

(2)通过免疫分选去除单个核细胞中的CD3⁺T淋巴细胞；