[发明专利]溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒

权利要求书

1.溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体的构建方法，包括以下步骤：

1)以lkta-F、lkta-R为引物，以溶血性曼氏杆菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到LKTA蛋白编码基因的PCR产物；

所述lkta-F具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

所述lkta-R具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

2)将所述LKTA蛋白编码基因的PCR产物和质粒载体分别进行NdeI和XhoI酶切，得到LKTA蛋白编码基因酶切片段和质粒载体酶切片段；

3)将所述LKTA蛋白编码基因酶切片段和载体酶切片段连接，得到重组质粒；

4)将所述重组质粒转化至大肠杆菌的感受态中，得到溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中PCR扩增的程序如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，30循环；72℃7min。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，步骤1)中PCR扩增的体系以50μl计，包括如下组分：

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中连接采用无缝克隆法进行。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述连接的体系以20μl计，包括如下组分：

6.根据权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，所述连接的温度为48～52℃，所述连接的时间为55～65min。

7.溶血性曼氏杆菌的检测抗原，其特征在于，所述抗原为权利要求1～6任意一项所述的方法构建的溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体经诱导表达的抗原。

8.一种基于间接ELISA法检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒，其特征在于，包括以下组成：

包被有权利要求7所述抗原的检测板；

抗血清；所述抗血清由权利要求7所述抗原免疫动物得到；

酶标-山羊抗小鼠Ig G；

样品稀释液；

底物显色液；

洗涤液。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原的包被浓度为450～650ng/mL。

10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括封闭液，所述封闭液为质量浓度为5％的脱脂乳。