[发明专利]溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒

说明书

本发明提供了溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒，属于基因工程技术领域，包括以下步骤：1)以lkta‑F、lkta‑R为引物，以溶血性曼氏杆菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增；2)将PCR扩增产物和质粒载体分别进行酶切，得到LKTA蛋白编码基因酶切片段和质粒载体酶切片段；3)将所述LKTA蛋白编码基因酶切片段和载体酶切片段连接，得到重组质粒；4)将所述重组质粒转化至大肠杆菌的感受态中，得到溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体。本发明提供的溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白具有良好的特异性，能够用来作为抗原标志物检测溶血性曼氏杆菌。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒。

背景技术

溶血性曼氏杆菌原名溶血性巴氏杆菌，是一种革兰氏阴性，不运动，无芽孢，氧化酶阳性，瑞士染色两极着色的兼性厌氧球杆状菌。在血液琼脂上，新分离的菌落呈微弱的β溶血。基于发酵阿拉伯糖和海藻糖的能力进一步分为两个不同的生物型(A，T)。十二个A生物型(血清型1、2、5、6、7、8、9、12、13、14、16、17)和四个T生物型(血清型3、4、10、15)已被鉴定。溶血性曼氏杆菌是一种严重危害家畜养殖业的人畜共患病，临床上可以导致牛羊出血性败血症等危害严重的病症。一般认为它是家畜家常带内源性病菌，当饲养环境不卫生，加上由于天气的突变、寒冷、闷热、潮湿拥挤、饲养营养缺乏、饲料突变、长途运输等诱因，动物产生应激反应，机体抵抗力降低，病菌可乘机侵入机体内，经淋巴进入血液，发生内源性感染。

目前对于溶血性曼氏杆菌的检测多采用PCR扩增的方法，例如中国专利CN201810149979.7，一种用于检测溶血性曼氏杆菌实时荧光PCR引物，公开了采用荧光PCR的方法检测血性曼氏杆菌。但是目前现有技术中没有能够有效的检测溶血性曼氏杆菌的抗原标志物，尚没有检测溶血性曼氏杆菌的免疫学方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒；所述LKTA蛋白原核表达载体能够表达高免疫活性的LKTA蛋白，能够实现溶血性曼氏杆菌的免疫检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体的构建方法，包括以下步骤：

1)以lkta-F、lkta-R为引物，以溶血性曼氏杆菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到LKTA蛋白编码基因的PCR产物；

所述lkta-F具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

所述lkta-R具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

2)将所述LKTA蛋白编码基因的PCR产物和质粒载体分别进行NdeI和XhoI酶切，得到LKTA蛋白编码基因酶切片段和质粒载体酶切片段；

3)将所述LKTA蛋白编码基因酶切片段和载体酶切片段连接，得到重组质粒；

4)将所述重组质粒转化至大肠杆菌的感受态中，得到溶血性曼氏杆菌LKTA蛋白原核表达载体。

优选的，所述步骤1)中PCR扩增的程序如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，30循环；72℃7min。

优选的，步骤1)中PCR扩增的体系以50μl计，包括如下组分：

优选的，所述步骤3)中连接采用无缝克隆法进行。

优选的，所述连接的体系以20μl计，包括如下组分：