[发明专利]有机磷降解酶高密度发酵制备方法

说明书

本发明公开了一种有机磷降解酶的高密度发酵制备方法，包括：(1)构建机磷降解酶毕赤酵母酵母表达载体并转入到毕赤酵母得到重组毕赤酵母酵母菌株；(2)将重组毕赤酵母酵母菌株依次在一级种子发酵罐、二级种子发酵罐和三级种子发酵罐中进行扩培得到三级种子；(3)将三级种子接入到发酵罐中的高密度发酵培养基中进行诱导培养；期间，通过补料罐补加发酵培养基。本发明主要通过对酵母细胞在种子罐和发酵罐生长和表达的分析，结合酵母生长和外源蛋白表达所需的营养物质、溶氧浓度、培养温度、发酵液的pH值，补料方式以及诱导过程中甲醇浓度、温度、pH、溶氧、残糖等因素对菌体表达的影响,有效提高了机磷降解酶的产量并降低了生产成本。

技术领域

本发明涉及有机磷降解酶的制备方法，尤其涉及有机磷降解酶高密度发酵的制备方法，属于有机磷降解酶的制备领域。

背景技术

针对农药残留对农副产品出口绿色壁垒的限制和对广大人民群众身体健康的威胁，此外，如何突破和解决农产品出口农药残留达标的难题，采用高科技手段和高科技技术势在必行，这也是中国出口企业面前必须解决的问题。

为解决农药残留等问题，有机磷降解酶的研究开发，自本世纪初启动了对有机磷降解酶的研究工作，并列入了中国国家‘863’计划项目。

在培养时采用了表达有机磷降解酶的重组毕赤酵母，其具有良好的安全性，无抗药性标记，培养过程中不分泌有毒物质和热源。“酶”属生物制剂，用“酶”来降解农药安全、彻底，没有毒副作用。“酶”可与蔬菜、水果等农产品的表面残留的农药发生化学反应，能破坏剧毒成分的结构，使剧毒农药瞬间变为无毒、可溶于水的小分子，以达到蔬菜水果的迅速脱毒，这种酶做成的洗涤液对环境不会有二次污染。

本发明人实验室已经完成利用毕赤酵母(Pichia pastoris)来高效表达有机磷降解酶，可通过高细胞密度发酵低成本生产有机磷降解酶制剂。酵母高效表达了降解酶，表达量达到6g/L，酶活性为1.6×10⁴U/mL发酵液，这是国内外目前报道的有机磷降解酶最高的表达量。此项目已经在实验室进行了小试、通过几次中试对生产降解酶的发酵工艺进行了探索。

但是如何将有机磷降解酶的小规模发酵生产转化为大规模工业化发酵生产以及如何如何有效降低大规模工业化发酵生产的生产成本，是目前亟待需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种有机磷降解酶高密度发酵制备方法，该制备方法能够将小规模发酵生产转化为大规模工业化发酵生产并有效降低大规模工业化发酵生产的生产成本。

本发明的上述目的通过以下技术方案来实现的：

一种有机磷降解酶高密度发酵制备方法，包括：(1)构建含有机磷降解酶的毕赤酵母酵母表达载体并转入到毕赤酵母得到重组毕赤酵母酵母菌株；(2)将重组毕赤酵母酵母菌株依次在一级种子发酵罐、二级种子发酵罐和三级种子发酵罐中进行扩培得到三级种子；(3)将三级种子接入到发酵罐中的高密度发酵培养基中进行诱导培养；期间，通过补料罐补加甘油或甲醇。

因为接种量多少决定着菌种在发酵罐中的生产速度；本发明人尝试采用大的接种量，由于种子液中含有大量体外酶类，有利于对基质的利用，缩短生长延迟期，并使生产均快速占领整个培养环境。为了缩短种子罐的培养时间采取了增大发酵罐配料体积和增加接种量两个办法：

1.在不改变培养基配方的前提下，分别增大一级种子罐、二级种子罐或三级种子罐的配料体积；

2.增加种子罐的接种量由5％增加至10％。

在生产过程中经常出现溶氧不足，并观察发酵液翻腾状况不理想。经几批生产后，发酵罐罐底堵塞，造成空气供应不足以及补料困难。为提高溶氧率，本发明对发酵罐进行了以下三个方面的改进：

1.首先将罐底中间位置进行改造，使空气喷出就被搅拌器打碎；

2.调整了管口与罐底距离；