[发明专利]一种双荧光筛选β-丙氨酸合成酶的方法

权利要求书

1.一种双荧光筛选β-丙氨酸合成酶的方法，其特征在于所述方法为：将GFP荧光报告基因与β-丙氨酸合成酶基因共同导入宿主菌中，接种含阿拉伯糖的基本盐培养基，在30～37℃诱导培养后，获得发酵液；取发酵液冻融破胞，破胞液即为粗酶液；取粗酶液加入L-天冬氨酸、1,2-邻二乙酰苯和巯基乙醇，于37℃条件下静置2h进行转化反应，取转化液在吸收波长355nm和发射波长445nm的条件下测定荧光值，记为R₁；取发酵液在吸收波长395nm和发射波长509nm的条件下测定荧光值，记为R₂；根据公式(1)计算β-丙氨酸合成酶的比活力，筛选获得β-丙氨酸合成酶；所述宿主菌为β-丙氨酸合成酶基因缺陷大肠杆菌；

R₁：转化液在激发波长355nm和发射波长445nm条件下测得的荧光发射强度；

R₂：发酵液在激发波长395nm和发射波长509nm条件下测得的荧光发射强度；

V₁：L-天冬氨酸向β-丙氨酸转化检测反应中加入终浓度50g/L L-天冬氨酸体积；

V₂：在激发波长355nm和发射波长445nm条件下检测荧光发射强度时加入的粗酶液体积；

V₃：L-天冬氨酸向β-丙氨酸转化检测反应中加入的转化液体积；

V₄：在激发波长395nm和发射波长509nm条件下检测荧光发射强度时加入的发酵液体积。

2.如权利要求1所述双荧光筛选β-丙氨酸合成酶的方法，其特征在于所述基本盐培养基组成为：K₂HPO₄·3H₂O 14g/L、KH₂PO₄ 5.2g/L、(NH₄)₂SO₄ 2g/L、MgSO₄ 0.3g/L、胰蛋白胨1g/L，果糖10g/L，溶剂为去离子水，自然pH值。

3.如权利要求1所述双荧光筛选β-丙氨酸合成酶的方法，其特征在于所述基本盐培养基中阿拉伯糖加入终浓度为1-10mM。

4.如权利要求1所述双荧光筛选β-丙氨酸合成酶的方法，其特征在于所述L-天冬氨酸加入终浓度为50g/L。

5.如权利要求1所述双荧光筛选β-丙氨酸合成酶的方法，其特征在于所述粗酶液制备方法为：将发酵液在-80℃快速冷冻30min，37℃融化30min，重复冷冻融化3次，获得粗酶液。

6.如权利要求1所述双荧光筛选β-丙氨酸合成酶的方法，其特征在于所述GFP荧光报告基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

7.如权利要求1所述双荧光筛选β-丙氨酸合成酶的方法，其特征在于所述β-丙氨酸合成酶基因与阿拉伯糖启动子连接后再与荧光报告基因共同导入宿主菌，所述连接阿拉伯糖启动子的β-丙氨酸合成酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。