[发明专利]一种双荧光筛选β-丙氨酸合成酶的方法

说明书

本发明公开了一种双荧光法筛选β‑丙氨酸合成酶的方法，将荧光报告基因与β‑丙氨酸合成酶基因共同导入宿主菌中，接种含阿拉伯糖的基本盐培养基，在30～37℃诱导培养后，获得发酵液；取发酵液冻融破胞，取破胞液即为粗酶液；取粗酶液加入L‑天冬氨酸，于37℃条件下静置2h进行转化反应将底物转化为β‑丙氨酸，取转化液在吸收波长355nm和发射波长445nm的条件下测定荧光值；取发酵液在吸收波长395nm和发射波长509nm的条件下测定荧光值，筛选获得高活力β‑丙氨酸合成酶；本发明体系操作简便、酶活测量稳定、酶活检测灵敏度高等优点，在β‑丙氨酸合成酶定向改造方面具重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程领域，更具体地，涉及β-丙氨酸合成酶的高通量筛选体系构建。

背景技术

β-丙氨酸主要用于如合成泛酸钙、肌肽、甜味剂、水净化絮凝剂、电镀缓蚀剂等。β-丙氨酸及其衍生物在医药、美容、食品、饲料、化工等领域应用广泛，市场需求日益上升。目前，主要通过化学法进行合成β-Ala。但是，化学合成法的工艺要求比较高，产生大量腈类副产物、无机盐等“工业三废”，且副反应较多，不利于产品的分离纯化。生物酶法生产β-丙氨酸更为环保，污染少，符合绿色生产要求，具重要应用前景。

多种微生物来源的β-丙氨酸合成酶编码基因能够在基因工程菌中表达。其中，来自于谷氨酸棒杆菌和枯草芽孢杆菌的β-丙氨酸合成酶(PanD)的稳定性和活性相对较高。谷氨酸棒杆菌来源的panD分别克隆到大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中表达，所产生的粗酶液活性分别可达27μmol/g·h和2073μmol/g·h(Dusch,AppliedEnvironmental Microbiology,1999,65:1530-1539)。大肠杆菌来源的PanD酶在催化过程中存在酶失活现象，这可能是与催化活性中心丙酮酰基发生了不可逆的氨基转移引起了酶活性的丧失(GreenChemistry,2009,11:1646-1652)。寻找高活性和高稳定性β-丙氨酸合成酶是解决生物法合成β-丙氨酸的关键。

邓思颖等人利用β-丙氨酸与邻二乙酰基苯和巯基乙醇形成的荧光物质表征PanD催化转化天冬氨酸的活力，建立了单荧光法高通量筛选PanD突变体蛋白(邓思颖等人，生物工程学报，2015,31：1184-93)。然而，该方法所测得PanD酶活为发酵液的总酶活，受基因表达条件和细菌生长状态影响较大。另外，该方法采用的培养基为丰富培养基，所形成的荧光背景干扰值较大。本发明在单荧光法的基础上，进一步利用GFP荧光强弱指征PanD表达量，从而更加稳定和准确地反映PanD酶的比活力，提高了高酶活PanD的检出率。此外，本发明采用基本盐培养基，大大降低背景荧光值，提高了酶活检测的灵敏度。

发明内容

本发明目的是提供一种检测β-丙氨酸合成酶比活力的双荧光检测方法，该方法利用重组质粒将β-丙氨酸合成酶编码基因和报告基因置于相同的诱导型启动子下，从而通过报告基因的表达水平检测β-丙氨酸合成酶的表达量；通过测定β-丙氨酸与邻二乙酰基苯和巯基乙醇形成的荧光物质的量确定β-丙氨酸合成酶的总酶活。根据上述两种荧光强度的比值计算β-丙氨酸合成酶的酶活。本发明的另一个目的在于提供上述检测方法在高通量筛选β-丙氨酸合成酶中的应用。

本发明采用的技术方案如下：

本发明提供一种双荧光高通量筛选β-丙氨酸合成酶的方法，所述方法为：将荧光报告基因与β-丙氨酸合成酶基因共同导入宿主菌中，接种含阿拉伯糖的基本盐培养基，在30～37℃诱导培养后，获得发酵液；取发酵液冻融破胞，取破胞液即为粗酶液；取粗酶液(体积记为V₂)加入L-天冬氨酸(L-天冬氨酸体积记为V₁)，于37℃条件下静置2h进行转化反应将底物转化为β-丙氨酸，取转化液(体积记为V₃)在吸收波长355nm和发射波长445nm的条件下测定荧光值，记为R₁；取发酵液(体积记为V₄)在吸收波长395nm和发射波长509nm的条件下测定荧光值，记为R₂；根据公式(1)计算β-丙氨酸合成酶的比活力，筛选获得高活力β-丙氨酸合成酶；