[发明专利]一种基于foldon介导的寡聚化阿魏酸酯酶的制备方法有效
申请号: | 201910073568.9 | 申请日: | 2019-01-25 |
公开(公告)号: | CN109609529B | 公开(公告)日: | 2021-12-31 |
发明(设计)人: | 李夏兰;张光亚;张雷 | 申请(专利权)人: | 华侨大学 |
主分类号: | C12N15/55 | 分类号: | C12N15/55;C12N15/81;C12N15/66;C12N9/18;C12R1/84 |
代理公司: | 厦门市首创君合专利事务所有限公司 35204 | 代理人: | 张松亭;秦彦苏 |
地址: | 362000 福建省*** | 国省代码: | 福建;35 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 基于 foldon 寡聚化 阿魏酸 制备 方法 | ||
1.一种基于foldon介导的寡聚化阿魏酸酯酶的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
设计如SEQ ID No.1所示的linker序列,并根据阿魏酸酯酶FAEO42807的氨基酸序列对应的核苷酸序列,设计基因序列His-fae-linker-foldon,并在两端分别加入SnaB I和NotI酶切位点,人工合成基因片段His-fae-linker-foldon;
将pPIC9K质粒及His-fae-linker-foldon用SnaB I和Not I双酶切,用T4连接酶连接质粒pPIC9K和基因片段His-fae-linker-foldon,构建并筛选pPIC9K/His-fae-linker-foldon质粒阳性克隆子,并电转化至P.pastorisGS115表达,得到pPIC9K/His-fae-linker-foldon工程菌;
将pPIC9K/His-fae-linker-foldon工程菌在培养基中诱导表达,诱导表达采用的诱导培养基的成分为:BMMY培养基,1~2%去淀粉麦麸;分离纯化获得寡聚化的阿魏酸酯酶;将寡聚化的阿魏酸酯酶保存在复合稳定剂中,所述复合稳定剂按质量份数计,包括:4~6份木聚糖酶且木聚糖酶的含量≥20000U/mL、2~4份纤维素酶且纤维素酶的含量≥10000U/mL、0.02~0.04份的MgSO4、7~9份的PEG400。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述将pPIC9K/His-fae-linker-foldon工程菌在培养基中诱导表达具体包括:将pPIC9K/His-fae-linker-foldon工程菌接种到种子培养基中,培养条件:28~30℃,150~250rpm,培养16~18h;将经过种子培养基培养后的培养液在2~4℃及3500~4500rpm离心4~6min,收集细胞,加入到所述诱导培养基中,培养条件:28~30℃,150~250rpm,培养96~100小时。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述种子培养基为BMGY培养基。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述pPIC9K/His-fae-linker-foldon工程菌包括如下制备过程:根据FAEO42807的氨基酸序列对应的核苷酸序列、His、linker及foldon基因序列和毕赤酵母的密码子偏好使用频率,设计并优化其基因序列His-fae-linker-foldon,并在两端分别加入SnaB I和Not I酶切位点,人工合成基因片段His-fae-linker-foldon;
将pPIC9K质粒及His-fae-linker-foldon用SnaB I和Not I双酶切,用T4连接酶连接质粒pPIC9K和基因片段His-fae-linker-foldon并转化至E.coli DH5α感受态细胞,筛选出的阳性克隆子并测序,得到pPIC9K/His-fae-linker-foldon质粒阳性克隆子,将其电转化至P.pastorisGS115。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:将pPIC9K/His-fae-linker-foldon质粒阳性克隆子转化至P.pastorisGS115中具体包括:将pPIC9K/His-fae-linker-foldon用Sac I酶切,利用电转化法将线性化片段转化至P.pastoris GS115感受态后,涂布于MD平板上筛选重组子,取MD平板上生长良好的菌落用牙签点种至YPD摇瓶中,培养16~18h后提取其基因组DNA,利用通用引物5’AOX、3’AOX进行PCR鉴定,得到表达阿魏酸酯酶的pPIC9K/His-fae-linker-foldon工程菌。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述分离纯化步骤包括:0~5℃,8000~12000rpm离心8~12min,获得的上清液即为粗酶液,粗酶液用Ni层析柱进行纯化得寡聚化阿魏酸酯酶。
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