[发明专利]一种基于foldon介导的寡聚化阿魏酸酯酶的制备方法

权利要求书

1.一种基于foldon介导的寡聚化阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

设计如SEQ ID No.1所示的linker序列，并根据阿魏酸酯酶FAEO42807的氨基酸序列对应的核苷酸序列，设计基因序列His-fae-linker-foldon，并在两端分别加入SnaB I和NotI酶切位点，人工合成基因片段His-fae-linker-foldon；

将pPIC9K质粒及His-fae-linker-foldon用SnaB I和Not I双酶切，用T4连接酶连接质粒pPIC9K和基因片段His-fae-linker-foldon，构建并筛选pPIC9K/His-fae-linker-foldon质粒阳性克隆子，并电转化至P.pastorisGS115表达，得到pPIC9K/His-fae-linker-foldon工程菌；

将pPIC9K/His-fae-linker-foldon工程菌在培养基中诱导表达，诱导表达采用的诱导培养基的成分为：BMMY培养基，1～2％去淀粉麦麸；分离纯化获得寡聚化的阿魏酸酯酶；将寡聚化的阿魏酸酯酶保存在复合稳定剂中，所述复合稳定剂按质量份数计，包括：4～6份木聚糖酶且木聚糖酶的含量≥20000U/mL、2～4份纤维素酶且纤维素酶的含量≥10000U/mL、0.02～0.04份的MgSO₄、7～9份的PEG400。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述将pPIC9K/His-fae-linker-foldon工程菌在培养基中诱导表达具体包括：将pPIC9K/His-fae-linker-foldon工程菌接种到种子培养基中，培养条件：28～30℃，150～250rpm，培养16～18h；将经过种子培养基培养后的培养液在2～4℃及3500～4500rpm离心4～6min，收集细胞，加入到所述诱导培养基中，培养条件：28～30℃，150～250rpm，培养96～100小时。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述种子培养基为BMGY培养基。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述pPIC9K/His-fae-linker-foldon工程菌包括如下制备过程：根据FAEO42807的氨基酸序列对应的核苷酸序列、His、linker及foldon基因序列和毕赤酵母的密码子偏好使用频率，设计并优化其基因序列His-fae-linker-foldon，并在两端分别加入SnaB I和Not I酶切位点，人工合成基因片段His-fae-linker-foldon；

将pPIC9K质粒及His-fae-linker-foldon用SnaB I和Not I双酶切，用T4连接酶连接质粒pPIC9K和基因片段His-fae-linker-foldon并转化至E.coli DH5α感受态细胞，筛选出的阳性克隆子并测序，得到pPIC9K/His-fae-linker-foldon质粒阳性克隆子，将其电转化至P.pastorisGS115。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：将pPIC9K/His-fae-linker-foldon质粒阳性克隆子转化至P.pastorisGS115中具体包括：将pPIC9K/His-fae-linker-foldon用Sac I酶切，利用电转化法将线性化片段转化至P.pastoris GS115感受态后，涂布于MD平板上筛选重组子，取MD平板上生长良好的菌落用牙签点种至YPD摇瓶中，培养16～18h后提取其基因组DNA，利用通用引物5’AOX、3’AOX进行PCR鉴定，得到表达阿魏酸酯酶的pPIC9K/His-fae-linker-foldon工程菌。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述分离纯化步骤包括：0～5℃，8000～12000rpm离心8～12min，获得的上清液即为粗酶液，粗酶液用Ni层析柱进行纯化得寡聚化阿魏酸酯酶。