[发明专利]一种基于foldon介导的寡聚化阿魏酸酯酶的制备方法

说明书

本发明公开一种基于foldon介导的寡聚化阿魏酸酯酶的制备方法，设计优化并合成基因片段His‑fae‑linker‑foldon；将pPIC9K/His‑fae‑linker‑foldon工程菌诱导培养，分离纯化获得寡聚化阿魏酸酯酶。本发明应用目标蛋白与foldon结构域融合可自发形成三聚体结构的特性，设计linker完成阿魏酸酯酶在毕赤酵母中融合表达，以提高阿魏酸酯酶的催化性能；在pPIC9K/His‑fae‑linker‑foldon工程菌的表达培养过程中，将去淀粉麦麸加入培养基中，以提高阿魏酸酯酶的表达量；将寡聚化阿魏酸酯酶保存在特制的复合稳定剂中，其酶活稳定性大大提高。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基于foldon介导的寡聚化FAE的制备方法。

背景技术

植物细胞壁中，酚酸类物质(如阿魏酸、咖啡酸、对香豆酸等)通过酯键与多糖(如阿拉伯木聚糖、果糖)的阿拉伯糖基或半乳糖基相连，或者通过醚键与木质素相连，形成致密的网状结构。阿魏酸酯酶(feruloyle steraseE.C3.1.1.73，FAE)是羧酸酯酶的一个亚类，它能水解植物细胞壁中阿魏酸与多糖之间连接的酯键，释放阿魏酸。FAE可以协同木质纤维降解酶，如木聚糖酶、纤维素酶及木质素酶，破坏木质纤维的致密网状结构，促进木质纤维降解。但目前报道的FAE的催化性能有待提高，需对酶进行改造，例如陈云华等在华侨大学学报(自然版)(2016.37(2):p.224-229)公开的阿魏酸酯酶O42807在毕赤酵母GS115中的表达，再例如李兵等在微生物学通报(2017.44(5):p.1065-1073)公开的黑曲霉FAE基因密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达。申请号为201410724759.4的发明专利公开了一种重组FAE的制备方法，利用阿魏酸酯酶O42807，密码子优化后人工合成其基因fae、构建pAO815/fae表达载体、构建pPIC9K/fae表达载体以及将pPIC9K/fae表达载体转化至毕赤酵母GS115中表达，得到重组FAE，SDS-PAGE分析显示其发酵上清液为单一条带，表观分子量为42kDa，酶活为4.7U/mL，比酶活力为31.4U/mg。该发明获得的重组FAE，与FAE O42807相比表达量有所提高，但表达量仍很低。以定点突变和定向进化为代表的蛋白质工程技术已经成功地筛选了具有优化特性的酶，但这些方法在改造酶时仍存在困难，如突变体库的建立和大量筛选工作。而通过固定化或化学修饰，有时也能提高酶的性能，但存在酶在固定化过程中会引起酶失活，且首次固定化成本高，与大分子底物反应较困难等缺点。